秀丽隐杆线虫中RNA干扰作用的遗传要点.docxVIP

秀丽隐杆线虫中RNA干扰作用的遗传分析姓名摘要：秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA引起的转录后水平的基因沉默（PTGS）现象，是研究基因功能的一种快速和高通量的方法。本次实验通过饲喂的方法，观察外源RNA分子对秀丽隐杆线虫发育的影响，从而了解RNA干扰的原理、特性及其应用。通过此次实验，我们达到了实验目的，取得了良好的实验效果。关键词：秀丽隐杆线虫、RNA干扰（RNAi）、饲喂法1．引言秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。在理想的条件下（充足食物，20℃）生命周期大约为4d。秀丽隐杆线虫成体长1～1.5mm，体宽约70μm，全身透明，以细菌为食，全身共有959个细胞。研究用的通常是秀丽隐杆线虫野生型（N2）。从1965年开始，Sydney Brenner以线虫为材料研究发育和神经生物学，现在已经成为经典模式生物之一。线虫性别是由常染色体和性染色体组的比例决定，有两种性别形式：雌雄同体和雄虫。雌雄同体的性染色体为XX，而雄虫性染色体为X0。雌雄同体的秀丽隐杆线虫既产生卵，又产生精子，可以与雄体交配，也可以自体受精进行繁殖，但雌雄同体之间不能异体受精。在雌雄同体自交繁殖中以0.2%的频率产生雄体（是减数分裂时性染色体不分开造成的）；而雄体与雌雄同体交配其后代两种性别比例为1:1。线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上。这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。此外，线虫还有许多组织特异性标记的品系。秀丽隐杆线虫的生命周期很短，20℃仅需4d。卵在通过受精囊时受精形成一层坚硬的几丁质的外壳，在母体内就开始分裂。从母体产出的卵大约处于30个细胞期。胚胎发生很有规律，从卵中孵化出约有550个细胞的幼虫。从孵化到成体，线虫经历4个幼虫阶段（L1～L4）和4次蜕皮，在身体大小和细胞数目两方面都有增长。蜕皮的时间（20℃）分别是孵化后13、21.5、29.5和41h；身体长度分别是350、470、640和890μm。秀丽隐杆线虫孵化后约50h开始产卵，每个雌雄同体可产200到300卵。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA引起的转录后水平的基因沉默（PTGS）现象，是研究基因功能的一种快速和高通量的方法。目前，在线虫中发展出3种不同的RNAi实验操作方法：① 注射（injection）dsRNA；②将线虫浸泡（soaking）于一定浓度的dsRNA溶液中；③ 用表达dsRNA的工程菌（E.coli）饲养（feeding）线虫。这3种方法各有优缺点，其中饲养法简单易行，适合高通量的基因功能筛选研究，已有用此方法对线虫全基因组进行筛选的报道。此次实验培养出RNAi型秀丽隐杆线虫的整体步骤是：提取秀丽隐杆线虫总RNA反转录合成cDNA，cDNA经过RT-PCR产生Gene，Gene经过双酶切产生Gene片段。另外L4440质粒双酶切形成线性L4440质粒。Gene片段与线性L4440质粒经过T4 DNA连接酶连接形成L4440质粒-Gene，L4440质粒-Gene转入到E.coli HT115（DE3）中进行阳性克隆。阳性克隆后进行PCR鉴定。之后将阳性克隆产物进行IPTG诱导形成Gene-dsRNA，将其通过饲喂法导入到秀丽隐杆线虫，能产生对目的基因表达和功能的特异性干扰，从而培养出RNAi型秀丽隐杆线虫。2．材料和方法2.1 材料、试剂和器材实验材料：秀丽隐杆线虫野生型（N2）、大肠杆菌OP50、大肠杆菌HT115（DE3）、6种不同的RNA干扰菌株HT115（含有能表达不同gene dsRNA的质粒，对应的性状编号分别为：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2、lon）实验试剂：LB液体培养基、NGM固体培养基实验器材：实体显微镜、显微镜、粘虫器（pick）、培养皿、锥形瓶、微量移液器、蓝枪头、黄枪头、白枪头、记号笔、酒精灯、火柴、高压蒸汽灭菌锅、封口膜2.2 方法2.2.1活化大肠杆菌OP50打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。取一个灭菌后的15mL离心管，用微量移液器向其加入3mL LB液体培养基，再向其中加入300μL大肠杆菌OP50。将15mL离心管放入37℃恒温摇床中振荡培养过夜（8～12h）。2.2.2 大肠杆菌OP50涂平板大肠杆菌OP50振荡培养过夜后，打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。用微量移液器取200μL菌液加入到NGM培养基平板中，轻微转动平板使菌液散开，用封