HPLC同时测定余甘子叶中槲皮素和山奈酚的含量.docVIP

HPLC同时测定余甘子叶中槲皮素和山奈酚的含量 　　[摘要] 目的 建立HPLC同时测定余甘子叶中槲皮素和山奈酚含量的方法。 方法 色谱柱：Thermo Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），梯度洗脱流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液，流速：1.0 ml/min，检测波长：370 nm，柱温：30℃，进样体积：20 μl。 结果 槲皮素和山奈酚分别在0.003～0.06 μg/μl（r=0.9995）、0.001015～0.0203 μg/μl（r=0.9993）范围内呈良好的线性关系，平均回收率（n=6）分别为98.83%（RSD=2.73%）、101.58%（RSD=2.21%）。 结论 建立了同时测定槲皮素和山奈酚含量的方法，可进一步完善余甘子叶的质量控制体系。 　　[关键词] HPLC；余甘子叶；槲皮素；山奈酚 　　[中图分类号] R282 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（a）-0050-03 　　余甘子（Phyllanthus emblica L.）是大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus）植物，是一味重要的传统民族药，已被载入多版中国药典[1]。余甘子不仅果实可入药，其种子、根、茎、叶、花亦可入药，如叶用于治疗水肿、皮肤湿疹、蛇咬伤、蜈蚣咬伤等[2-3]。随着药理学研究的展开，余甘子在抗菌[4]、抗肿瘤[5]、抗氧化[6]、抗动脉粥样硬化[7-8]、抗乙型肝炎病毒[9]、保肝[10]、增强免疫[11-12]等方面的作用得到了进一步的认识。余甘子有多种化学成分，其中槲皮素和山奈酚为余甘子叶的活性成分[13]，本研究建立同时测定余甘子叶中槲皮素和山奈酚含量的方法，以期为进一步完善余甘子叶的质量控制体系提供依据。 　　1 仪器与试剂 　　1.1 仪器 　　高效液相色谱仪：型号Agilent1100（含在线真空脱气机、高压四元梯度泵、标准自动进样器、智能化柱温箱、可变波长检测器、二极管阵列检测器）；Series色谱工作站（美国安捷伦科技公司）；SB3200T超声波清洗仪（上海能信超声有限公司）；LG16-W高速微量离心机（美国医用离心机厂）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯）；Millipore Simplicity-185超纯水器（美国密理博公司）。 　　1.2 试剂 　　槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100081-200406）；山奈酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：11081-200405）。余甘子叶样品经广西中医学院药用植物教研室刘寿养副教授鉴定。乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。 　　2 方法与结果 　　2.1 实验条件的设定 　　色谱柱：Thermo Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速：1.0 ml/min，检测波长：370 nm，柱温：30℃，进样量：20 μl/次，梯度洗脱流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱程序见表1。理论塔板数以槲皮素和山奈酚峰计算应≥3000，分离度应1.5，在此色谱条件下，样品分离良好，结果见图1。 　　表1 梯度洗脱时间程序表 　　图1 余甘子叶的HPLC色谱图 　　A.槲皮素峰；B.山奈酚峰 　　2.2 标准对照品溶液的制备 　　取槲皮素对照品约0.60 mg，精密称定，置于10 ml具塞容量瓶中，加100%甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，即得临时溶液。取山奈酚对照品1.02 mg，精密称定，置于50 ml具塞容量瓶中，精密加入上述临时溶液1 ml，加甲醇溶解至刻度，摇匀，即得。 　　2.3 供试品溶液的制备 　　取样品粉末约1 g，精密称定，置50 ml锥形瓶中，精密加入25 ml甲醇，称重，超声处理45 min，冷却，用甲醇补足损失的重量，再用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。 　　2.4 线性关系的考察 　　取前述的标准对照品溶液5份，体积分别为0.5、2、4、8、10 ml；分别置于各自的10 ml容量瓶中，分别加甲醇至刻度，摇匀。吸取上述各溶液及2.2项下制备的标准对照品溶液各10 μl，按2.1项下的实验条件，注入色谱仪，进行测定。以峰面积Y作为纵坐标，进样浓度量X（μg/μl）作为横坐标绘制标准工作曲线，进行线性回归：槲皮素Y=3342X-17.70，r=0.9995；山奈酚Y=2986X-7.10，r=0.9993，线性范围分别槲皮素0.003～0.06 μg/μl，山奈酚0.001015～0.0203 μg/μl。 　　2.5 精密度试验 　　取2.2项下的标准对照品溶液20 μl，连续进样6次，对槲皮素和山奈酚的峰面