HPLC法同时测定银黄颗粒中三种黄酮类成分的含量.docVIP

HPLC法同时测定银黄颗粒中三种黄酮类成分的含量 　　[摘要] 目的 建立同时测定银黄颗粒中三种黄酮类成分（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素）的含量的高效液相色谱方法。 方法 采用Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以甲醇-0.2%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速1.0 ml/min，检测波长为275 nm，柱温30℃，进样量20 μl。 结果 三种成分在建立的方法下分离良好，在考察的浓度范围内，浓度与峰面积之间呈良好的线性关系（r0.9997）；回收率（n=9）均在94.4%～1a04.7%范围，RSD均2.1%。 结论 本方法简便、准确，精密度高，重复性好，可以用于银黄颗粒的质量控制。 　　[关键词] 高效液相色谱法；银黄颗粒；黄酮类成分；含量测定 　　[中图分类号] R286 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（a）-0053-03 　　银黄颗粒是由金银花和黄芩两味中草药提取物组成的复方制剂，具有清热、利咽、解毒作用。临床上主要用于治疗外感风热引起的咽干、咽痛、发热以及扁桃体炎、急慢性咽炎、上呼吸道感染等多种疾病。黄芩富含多种物质，其中含量较高并且具有显著药理活性的化合物是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷等黄酮类化合物[1-7]。银黄颗粒大多以黄芩苷和绿原酸作为质量控制指标[8-11]，监测其内在质量，因这种简便单一的质量控制模式存在一定缺陷，为非法添加埋下了隐患。 　　中国药典（2010版）[12]对银黄颗粒的质控是通过测定绿原酸和黄芩苷两种成分，对这两种测定成分采用不同的样品处理方法及色谱条件，步骤繁琐，且对具有活性成分的黄芩素、汉黄芩苷未进行有效质控。 　　选择黄芩苷等三种成分作为质量控制的指标，可有效地反映银黄颗粒真正的内在质量，并为全面评价其质量控制提供有效依据。本试验以金银花和黄芩两种中药材的已知有效成分为基础，应用梯度洗脱法构建能同时测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素三种化学成分的高效液相色谱法，旨在为银黄颗粒的内在质量控制提供更好的依据。 　　1 仪器与试剂 　　美国Agilent 1260高效液相色谱仪系统，AE240电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多）。对照品购于中国药品生物制品检定所；银黄颗粒来自本院和药店，生产厂家及药品批次分别为：①云南永安制药有限责任公司（批号1100303）、②西安交大药业（集团）有限责任公司（批号110624）、③河南宛西制药股份有限责任公司（批号110701）。应用的试剂中，乙腈、甲酸、乙酸、甲醇为色谱纯，实验用水为纯化水，其余所用试剂均为分析纯。 　　2 方法与结果 　　2.1 色谱条件 　　色谱柱：Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.2%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：（A：0～15 min，20%；15～40 min，20%～40%；40～80 min，40%～45%；80～90 min，45%～50%；90～120 min，50%～55%；120～135 min，55%）；流速：1.0 ml/min；检测波长：275 nm；柱温：30℃；进样量：20 μl。 　　2.2 供试品溶液的制备 　　将银黄颗粒去外包装，用适当方法研细，精密称取细粉1.0 g，置于50 ml量瓶中，加入甲醇40 ml，超声提取20 min（功率350 W，频率45 KHz），放至室温，用甲醇稀释至刻度。混合均匀，取上清液过滤，即得。 　　2.3 对照品储备液的制备 　　精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的对照品适量，分别用甲醇溶解稀释至刻度，配制成浓度为1 mg/ml的对照品储备溶液，备用。 　　2.4 系统适用性试验 　　分别准确量取适量的各对照品储备液，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素浓度分别为400.00、100.00、80.00 μg/ml的混合溶液作为对照品。取对照品溶液、供试品溶液，分别测得三种黄酮类成分的混合对照品、样品溶液的色谱图（图1）。通过计算分离度1.5，理论板数均3000。 　　图1 275 nm下的HPLC-DAD色谱图 　　A.混合对照品，B.银黄颗粒样品；1.黄芩苷，2.汉黄芩苷，3.黄芩素 　　2.5 线性关系的考察、检出限和定量限 　　精密吸取混合对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，逐步稀释成一系列不同浓度的对照品溶液，进行测定。以信噪比10∶1求得定量限（LOQ），以信噪比3∶1求得检出限对照品（LOD）。按规定色谱条件测定。结果表明三种化合物均有良好的线性关系，定量检出限（S/N=10）在1.08～1.55 μg/ml（表