现场---氯乙烯要点.docxVIP

现场——氯乙烯胞质阻滞微核实验1.2.3胞质阻滞微核试验（CBMN）主要材料与仪器RPMI1640培养基（Gibco）、青霉素和链霉素 (Hyclone)、胎牛血清 (Gibco)、细胞松弛素B（Sigma）、植物凝集素PHA(国产)、甲醇（分析纯）、冰醋酸（分析纯）、氯化钾（分析纯）、Giemsa染液（Sigma）、二甲基亚砜DMSO(Sigma)、载玻片（经玻璃清洗液清洗后、泡酸24小时、蒸馏水冲洗至少6遍，置于4℃蒸馏水中备用）、CO2恒温培养箱 (Thermo)、离心机 (Thermo)、六孔板、15ml离心管（corning）、显微镜。试剂配制1）完全1640培养基：10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100和/mlm链霉素，1640基础培养基，分装，4℃保存备用。2）细胞松弛素B应用液(细胞松弛素B C29H37NO3 是从真菌类Helminthosporium de－mariodeum中分离得到的代谢产物。是以希腊语的cytos（细胞）和chalasis（松弛）组合而命名的。在许多动植物细胞的细胞运动中，特别是可逆地抑制同微丝系有关的现象。例如在0.5—1.0微克/毫升浓度下作用24小时，会使鼠的培养纤维芽细胞只进行核分裂，而细胞质的分裂受到抑制，从而成为多核细胞。)用DMSO将粉末状细胞松弛素B（Cytochalasins B, Cyto-B）溶解，用无菌生理盐水稀释，配成存储液；用无菌生理盐水稀释至151.5ug/ml，配制成应用液，-20℃，避光保存，备用。3）植物凝集素PHA每支PHA粉末用2ml无菌生理盐水溶解，每4ml培养基加入0.2mlPHA溶液，混匀。4）0.075mmol/L氯化钾低渗液1.1175mg氯化钾，加200ml双蒸水混匀，37℃预热，备用。5）固定液甲醇（预冷）：冰醋酸(v:v)=3:1，混匀，现用现配，4℃预冷备用。6）10%Giemsa染液Giemsa原液:PBS(v:v)=1:9,混匀，过滤备用 实验方法经过研究对象的知情同意，在采集血样做血常规、血生化等项目的同时，采取外周静脉血1ml，置于肝素抗凝管内，常温保存，4小时内运至实验室。1）铺6孔板：每孔加入0.5ml 新鲜肝素抗凝全血和4.5ml含PHA的1640完全培养基，混匀后置于37℃，5%CO2培养箱，培养44h。2)加细胞松弛素B：每孔加入200ul应用液，轻柔地吹打混匀，终浓度为6ug/ml。3）继续培养至72h，收获细胞。4）培养细胞收获①收集细胞至15ml离心管，800rpm，离心10min，弃上清；②加入37℃预热的低渗液4ml,轻柔混匀，37℃水浴4min，加入固定液4ml,立即混匀，固定5min，800 rpm，离心10min，弃上清；③再加入固定液5ml,立即混匀，固定10min，800 rpm，离心10min，弃上清；复步骤③；⑤滴入少许新鲜固定液，重悬细胞，吹打混匀，细胞悬浮液呈均匀的半透明状；细胞悬液从10cm高度滴到冷水浸过的载玻片上，室温干燥Giemsa染液染色7min,自来水冲洗，晾干，待检5）镜检低倍镜下找到有细胞的视野，转至高倍镜观察，计数1000个细胞膜完整、细胞核边界清晰的双核细胞，并计数出现微核的双核细胞数。微核的判定标准[73]：①细胞完整、边界清晰可辨；②双核理想状态下不能重叠，若两核重叠，在核边界能分辨清楚的情况下仍可计数为双核细胞；③微核直径为主核的1/16-1/3；④微核染色与主核一致，颜色可略浅，有较明显的边界，若不能判断可换油镜以确认；⑤微核不能折光，以与染料颗粒区分。计数1000个双核淋巴细胞中含一个、两个或多个微核的细胞数，算出双核微核细胞率（‰）。图2-1-2为正常的含有一个微核的双核淋巴细胞（1000×）。二．问卷三．指标检测mRNA和microRNA:1.2 实验材料和方法（所有操作均在超净工作台内完成）1.2.1 试剂和仪器人外周血淋巴细胞分离液（购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）裂解液MZ （购自天根生化科技（北京）有限公司）miRNA提取分离试剂盒（DP501，离心柱型，购自天根生化科技（北京）有限公司）miRNA cDNA第一链合成试剂盒（KR201，购自天根生化科技（北京）有限公司）miRNA 荧光定量检测试剂盒（FP401，购自天根生化科技（北京）有限公司）氯仿（分析纯）无水乙醇（分析纯）离心机荧光定量96孔10ul 反应板（Thermo）Real time PCR仪（PikoReal96, Thermo）Eppendorf 微量移液器1.2.2 样品处理取新鲜肝素抗凝血1ml, 加灭菌生理盐水1ml 混匀后，缓慢小心地加入2ml人外周血淋巴细胞分离液。400g 离心20min。离心管分4层，从上至下分别为血浆层、淋巴细胞层、分离液层和