流体剪切力与17―β雌二醇对MC3T3―E1细胞增殖活性协同作用的研究.docVIP

流体剪切力与17―β雌二醇对MC3T3―E1细胞增殖活性协同作用的研究 　　[摘要] 目的 探讨对体外培养的成骨细胞增殖活性促进作用最佳的17-β雌二醇的浓度及作用时间、流体剪切力（FSS）的力值及作用时间，以及此双因素共同作用对成骨细胞增殖活性的影响。方法 成骨细胞系MC3T3-E1细胞 　　传代培养后，分别对其施加不同浓度的17-β雌二醇和不同力值的FSS，采用MTT法检测细胞的增殖情况，并检测ALP活性，筛选出最佳的浓度及力值；再将二者共同作用于MC3T3-E1细胞，检测其增殖情况和ALP活性。结果 浓度为10-8 mol?L-1的17-β雌二醇作用5 d时，MC3T3-E1细胞的增殖及ALP活性优于其他17-β雌二醇处理组；FSS力值为12×10-5 N作用60 min时细胞的增殖及ALP活性大于其他FSS处理组。当二者同时作用于MC3T3-E1细胞时，细胞的增殖活性大于任一单因素处理组。结论 17-β雌二醇和FSS对成骨细胞活性的促进作用皆有一个适宜的阈值；二者具有协同作用，对成骨细胞分化及增殖功能的影响优于单一因素作用。 　　[关键词] 17-β雌二醇； 流体剪切力； 协同作用； 成骨细胞 　　[中图分类号] Q 25 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.016 正常状态下骨形成与骨吸收处于一种平衡状态，该平衡是由成骨细胞介导的新骨形成和破骨细胞介导的骨吸收作用来实现的。MC3T3-E1细胞株是成骨分化研究中的经典细胞株，很多学者将其用于骨形成机制的研究[1]。影响成骨及破骨细胞增殖及活性的因素有很多，雌激素和应力是影响成骨细胞活性及增殖的重要因素[2]。 　　研究[3-4]表明：雌激素对成骨细胞的功能有促进作用。还有学者[5]发现：流体剪切力（fluid shear stress，FSS）能够活化成骨细胞的跨膜受体，促进成骨细胞增 　　殖。Yeh等[6]通过研究证实：雌激素可以通过雌激素受体增加成骨细胞对FSS的敏感性。本实验采用MC3T3-E1成骨细胞系，对其施加不同浓度的17-β雌二醇及不同力值的FSS，探讨17-β雌二醇、FSS以及二者共同作用对成骨细胞增殖活性的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验材料 　　MC3T3-E1第3代细胞株（ADCC公司，美国）。17-β雌二醇、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT（Sigma公司，美国），胰蛋白酶（Gibco公司，美国），含105 U?L-1青霉素及100 mg?L-1链霉素的α-MEM培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒（南京建成生物有限公司），Triton X-100（Fluka公司北京原生生物 　　技术有限公司分装）。Multiskan MK3酶联免疫检测仪（Thermo公司，美国），平行板流室加力装置（四川大学华西口腔医学院FSS课题组提供）。 　　1.2 细胞培养及传代 　　将第3代MC3T3-E1细胞系用α-MEM培养基（含体积分数为10%胎牛血清、105 U?L-1青霉素及100 mg?L-1链霉素）在37 ℃、5%CO2潮湿环境下培养，2～3 d换 　　液1次，待细胞均匀一层铺满培养瓶底部时，用0.25%胰蛋白酶消化获得细胞，用于后续实验。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 17-β雌二醇处理分组 将用于17-β雌二醇处理的细胞等分为A、B、C、D、E共5组，每组再分为4个小组，分别标记为A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4……以此类推。在A、B、C、D组的培养基中分别添加浓度为10-10、10-9、10-8、10-7 mol?L-1的17-β雌二醇，每一大组的4个小组分别培养1、3、5、7 d。E组为对照组，不加17-β雌二醇，其余处理同实验组。设置30个重复样本。 　　1.3.2 FSS处理分组 将用于FSS处理的细胞等分为a、b、c、d、e、f共6组，每组再分为3个小组，分别标记为a1、a2、a3、b1、b2、b3……以此类推。将各组细胞接种于放置在六孔板中的盖玻片上，移入细胞培养箱静置培养至细胞完全贴壁。采用平行板流室加力装置分批次对a、b、c、d、e组细胞分别施加每平方厘米力值为2×10-5、6×10-5、12×10-5、20×10-5、25×10-5 N的力，每组中3个小组的作用时间分别为15、60、120 min。f组为对照组，不施加FSS，其余处理同实验组。设置30个重复样本。 　　1.3.3 FSS+17-β雌二醇双因素处理分组 经上述实验筛选出17-β雌二醇的最佳浓度和最佳培养天数后，设置双因素作用组Ⅰ、FSS组Ⅱ、17