基因工程-克隆载体09.pptVIP

基因工程载体与受体细胞 质粒载体 Plasmid 噬菌体载体 柯斯质粒载体 病毒载体 第二代腺病毒载体 在E1、E3缺失的基础上进一步去除了E2区和(或) E4区,减弱病毒蛋白的表达 宿主的免疫反应仍然是获得转基因长期表达和重复使用腺病毒载体的主要障碍 第三代腺病毒载体 去除了病毒载体中所有的编码基因,只保留其复制和包装必需的顺式作用元件，这种载体可避免RCAs 的产生,大大降低宿主对病毒的细胞免疫反应,利于载体的长期应用,而且可使腺病毒载体的克隆容量接近37kb ,其它功能由辅助病毒提供,空壳载体 腺病毒载体的优点 ①稳定性强,病毒基因组重排频率低 ②安全性较好, 无需整合,基因毒性低; ③插入片段大 ④宿主范围广 ⑤靶向性 源于P1 的人工染色体(PAC) PAC 载体以F 因子和噬菌体P1 为基础构建,兼有二者的特点,通过电转化可将PAC 导入大肠杆菌。 特点：PAC 载体可以插入约300kb 的外源片段,插入的外源DNA 没有明显的嵌合和缺失现象,可以稳定遗传及高效扩增。 双元细菌人工染色体(binary BAC ,BIBAC) 和可转化人工染色体( transformation-competent artificial Chromosome ,TAC) ,这些载体不仅具有较大的克隆容量,而且具备了直接转化植物进行功能互补实验的功能。 穿梭功能 结合BAC 载体和Ti 质粒的特点 表达载体 1、基本成分 ① 复制起点 ② 筛选基因 ③ MCS ④ 参与控制转录与转译的遗传元件 启动子、转录终止子 转译起始序列、转译增强子、转译终止子 动物病毒载体的特点 1、真核表达问题：基因表达 2、自主感染、整合：转基因 3、基因治疗 4、重组疫苗：无毒、多价、多联 5、种类繁多，优势突出 动物病毒载体的种类 1、昆虫病毒载体 2、哺乳动物病毒载体 昆虫病毒载体 多角体病毒（杆状病毒）载体（NPV载体）--转移载体。 杆状病毒为环状dsDNA,(30kb),其包涵体称为多角体 苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV) -秋粘虫 家蚕核多角体病毒(BmNPV)-家蚕 棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)-棉铃虫 baculovirus expression vector system ,BEVS) Sf9细胞 特 点 属于真核表达体系 基因组大，容量大（10kb） 安全：不感染脊椎动物，其启动子在哺乳动物细胞中无活性 产量高：使用的是晚期启动子，故外源产物对表达系统无影响，多角体蛋白启动子和p10启动子为强启动子 可在昆虫细胞培养物和虫体内表达 多角体蛋白基因和p10基因为非必需区，可供插入外源基因，重组病毒因插入失活不形成多角体，提供选择标记，且不能形成包涵体，因而不能像野生型病毒那样在外界存活 哺乳动物病毒载体 　 应用最多的是双股线状DNA病毒，如痘病毒、疱疹病毒、腺病毒等，另外，还有环状双链DNA的SV40病毒以及反转录病毒 SV40病毒 环形双链的DNA，分子质量较小；它是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒；包装范围相当严格；寄主细胞的局限性 1.晚期区段取代型载体 外源DNA取代晚期DNA 辅助病毒 一、取代型 2.早期区段取代型载体 外源DNA取代SV40 DNA的早期区 通过构建能持久表达病毒T抗原的特殊细胞系，能够互补早期区段取代载体丧失的合成T抗原的功能。细胞系：COS细胞系（ SV40早期区段DNA，转化正常的猿猴受纳细胞CV-1而得到的。故特称为COS(CV-l，origin, SV40)细胞系 HFS(human fibroblasts，SV40） 能够组成地表达T抗原 二、重组的病毒-质粒载体 1.由病毒的早期区段和复制起点同大肠杆菌的质粒分子重组而成的，所以又叫做病毒-质粒载体(viral-plasmid vector) 只含有SV40复制起点的DNA片段，即所谓的微型病毒复制子(mini-viral replicon)，插入在大肠杆菌的质粒载体上，构成了一种新型的病毒-质粒载体，称为微型病毒复制子-质粒载体 2.微型病毒复制子-质粒载体 ITR ITR E1 E2 E3 E4 IVa2 VA L1 L2 L3 L4 L5 腺病毒的基因组DNA 线性双链DNA，长约36Kb，两端各有一个反向末端重复区（inverted terminal repeat ITR），ITR内侧为病毒包装信号,为病毒复制必需区。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区又可分为早期转录