2013食品安全检验技术实验参考材料.doc

实验一 蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的生物化学测定 一、实验目的 通过实验了解和掌握蔬菜中农药残留量的生物化学测定的原理和方法，比较两种常见的生物化学测定法，即速测卡法和酶抑制率法的异同。 二、实验原理 生物化学测定方法根据其检测手段又可分为速测卡法和酶抑制率法（分光光度法）。速测卡法的测定原理是根据胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸和靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药。 酶抑制率法的原理是在一定条件下，有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下酶催化乙酰胆碱水解生成胆碱，胆碱在显色剂的作用下产生黄色物质，该黄色在412nm处有特征吸收峰，用可见分光光度计或农药残毒快速检测仪进行测定。 三、试剂及仪器 1、仪器 常用天平、农药残毒快速检测仪、台式恒温培养箱、微型混合器。 2、试剂 农残速测卡：固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片； pH8.0缓冲溶液：取11.9mg无水磷酸氢二钾与3.2mg磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解； 显色剂：取160mg二硫代二硝基苯酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，在4℃冰箱中保存； 底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱8.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置于4℃冰箱中保存，保存期不超过一周； 乙酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，但吸光度值应控制在0.3以上。 可选用以上试剂制备的试剂盒（含缓冲液、显色剂、底物、乙酰胆碱酯酶，不同厂家生产的试剂盒具体试验操作不完全相同）。 四、测定步骤 1、速测卡法（纸片法） ① 滴2~3滴洗脱液在菜叶正面近叶尖部分，用另一片菜叶滴液处轻轻摩擦。 ② 取一片速测卡，将菜叶上洗出的水滴1滴在白色药片上，静置10min，保持药片润湿。 ③ 将速测卡对折，用手捏3min。 ④ 打开速测卡，白色药片变蓝色为正常反应，不变蓝或显淡蓝色说明有过量有机磷或氨基甲酸酯类农药残留。每批同时做一片无农药对照。 2、酶抑制率法 ① 取2g切碎样本，置于提取瓶内，加入20mL提取试剂，震荡1~2min；倒出上清液，静置3~5min。于平底小试管中加入100μL酶液、3mL样品提取液、100μL显色剂，在37~38℃下培养15min。 ② 于待测的小试管内加入100μL底物，倒入比色杯内，进行仪器测定。同时做对照组试验。（注：不同试剂盒的添加量不完全相同，具体按说明书操作。） 五、结果计算和判定 1、速测卡法 速测卡检测结果以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制（阳性）和未抑制（阴性）来表示。强阳性结果：速测卡白色药片不变色，说明农药残留量高；弱阳性结果：速测卡白色药片显浅蓝色，说明农药残留量相对较低；阴性结果：速测卡白色药片显天蓝色或与空白对照卡相同。 表1-1所示为速测卡法对我国常见使用的一些有机磷和氨基甲酸酯类农药检出限 式中：ΔAc——对照管溶液反应3 min吸光度的变化值； ΔAt——样品管溶液反应3 min吸光度的变化值。 当样品提取液对酶的抑制率＜50%时，表示样品农药残留检测合格；若抑制率≥50%，表示样品中可能含有高浓度的有机磷或氨基甲酸酯类农药，则实验需要重复两次以上。 表1-2所示为酶抑制率法对部分农药的最低检测限。 表1-2 分光光度法对几种农药的最低检测限（mg/kg） 农 药 检测限 农 药 检测限 农 药 检测限 甲胺磷 1.5 甲基异硫磷 5.0 灭多威 0.1 敌敌畏 0.01 克百威 0.002 敌百虫 0.2 氧化乐果 0.8 马拉硫磷 4.0 对硫磷 0.1 乐果 1.0 辛硫磷 0.3 六、注意事项 1、速测卡法检测中，当温度低于37℃时，酶反应的速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间应相对延长。延长时间的确定，应以空白对照卡用手指捏3min时可以变蓝色为准，且样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。 2、速测卡法检测中，预反应后药片表面必须保持润湿。 3、采用酶抑制率法测定韭菜、生姜、葱、蒜、辣椒、胡萝卜等蔬菜中的农药残留时，不要剪得太碎，浸提时间不能太长，因为这类蔬菜含有较多可使酶失活的成分，易产生假阳性。对于这类蔬菜必要时可采取整株浸提。一些叶绿素含量较高的蔬菜也是如此。 当温度低于37℃时，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应适当延长，延长时间的确定应以胆碱酯酶空白对照测试3min的吸光度变化值在0.3以上，即可往下操作。且样品放置时间应与空白对照溶液放置的时间一致。 当吸光度过大无法读取时，说明测定溶液浑浊有干扰。 七、思考题 1、影响速测卡法和酶抑制率法测定农药残留量准确性的因素有哪些？如何减少其影响？ 2