流式细胞技术及应用.doc

流式细胞技术及应用 一、流式细胞技术及流式细胞仪工作原理 流式细胞技术（Flow Cytometry, FCM） 是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。 Flow Cytometor, FCM）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的检测仪器。 流式细胞仪仪器构造 1. 流动室及液流驱动系统 2. 激光光源及光束形成系统 3. 光学系统 4. 信号检测与存贮、显示、分析系统 5. 细胞分选系统 技术特点 1单细胞分析：任何单细胞悬液，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞，实体组织经处理后制成单细胞悬液。 2 快速分析：极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细 胞仪可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个 3多参数分析：可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数等更为准确。 4定性或定量分析：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。 工作原理 1液流驱动系统 将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不含细胞或微粒的缓冲液（又称鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动，形成一个圆形的流速（即鞘流），待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域。 2激光光源 目前FCM大多采用氩离子气体激光器，波长为488nm。激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。用聚焦透镜对激光光束聚焦后，可以在照射区得到一个近似扁平的椭圆形光斑，其厚度可达20μm。当流动的细胞经过光斑时才能被激光照射并产生光散射和发射荧光。 3光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。 4信号检测，可获得的信息。 （1）散射光信号 前向角散射(Forward Scatter, FSC ) ，相对细胞大小。 侧向角散射(Side Scatter, SSC)，相对细胞颗粒密度和内部复杂度。 （2）荧光信号，染色过细胞的相对荧光强度。 5数据的存贮、显示与分析 FCM数据存贮的方式均采用列表排队方式；数据的显示通常有一维直方图、二维点图等。 1、对细胞抗原的检测 各种血细胞都有相应的抗原表达方式，并且不同成熟阶段表达的抗原种类也不完全相同。通过免疫荧光标记技术将细胞表面抗原同标记有特异染料的一种以上单克隆抗体结合后，在流式细胞仪同一激光光源激发下产生几种特异荧光色，由荧光检测器对每个细胞的体积、结构、荧光种类及性质等多种参数同时测定，分析得到细胞群体的多种表面抗原的表达情况。FCM也可用于特异性细胞质内或细胞核上抗原的检测，并协同其他实验指标预示疾病的预后。FCM也为网织红细胞计数提供了快速、准确的测试手段，可通过某些染料与网红中RNA结合，在FCM测量时发出特定颜色的荧光，进行单参数定量RNA。 2、对淋巴细胞及其亚群的分析 FCM进行淋巴细胞及其亚群的分析，分类更客观、准确。使用流式细胞仪的绝对计数系统，即加入已知数量的荧光微球，通过仪器测定时收获的细胞数量和微球数量及血液标本用量，直接得到每微升全血中T淋巴细胞亚群的绝对计数（个/μl） 。用FCM检测PBMC中p24、p24nef、p18等HIV抗原阳性的CD4 + 细胞数可监测体内HIV复制情况，结果表明HIV抗原阳性细胞与CD4 + 细胞数量负相关 3、白细胞分类分析 利用FCM的体积测定和细胞结构测定来检测每个白细胞的光散色强度，它与细胞体积、细胞膜结构、细胞核形状、细胞质性状等多种因素有关，经过分析可得到中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的检测结果。这种方法应用于血细胞计数速度快、结果准确，大大提高了临床实验室的工作效率 4、病毒抗原的检测 FCM既可用于检测受染细胞内的病毒抗原，也可检测受染细胞表面的病毒抗原。由于FCM检测的是单个细胞，因此FCM检测受染细胞适用于血液、支气管灌洗液、尿标本以及经酶消化过的组织细胞。同时由于FCM为多参数分析，因此可在单个细胞中同时获得多个分析参数并能定量检出受染细胞。当用不同荧光染料标记不同的病毒抗原特异性抗体或将特异性病毒抗体与不同大小的乳胶颗粒相联时，FCM可同时检测到同一样本中的多种病毒或病毒抗原 5、病毒抗体检测 利用吸附有