碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定.docx

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆 低浓度乙酸钠：低渗破膜 低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP 加入不同有机溶剂重复离心 正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质 33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。*每毫升样品中的蛋白质毫克数。3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理 (3).米氏常数测定 Km 即为米氏常数，Vmax为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 Vmax, Km = [S] ＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。 二. 器材 721分光光度计 台式离心机 恒温水浴锅 微量移液器 托盘天平 匀浆器 试管三. 试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液 称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液 称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液 取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4.丙酮(分析纯).5.95%乙醇(分析纯).6.Tris缓冲液(Ph8.8)称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液 称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g, 4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8.0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液 称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9.碱性溶液 量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液 称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液 称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12.酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作 (2). “碱性磷酸酶比活性测定”实验操作1.样品中碱性磷酸酶活性测定:(1).取5支试管,编号,按表1操作:表1A’ B’ C’ D’ 标准 空白各阶段稀释液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 - -0.1mg/ml酚标准液(ml) - - - - 0.1 -pH8.8Tris缓冲液(ml) - - - - - 0.1置37℃水浴中保温5分钟复合基质液(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混匀,37℃水浴中准确保温15分钟.保温结束后,各管立即加入1.0ml碱性溶液终止反应,再加入0.5%铁氰化物钾2.0ml,立即混匀,静置10min,在510nm波长下比色测定.2.酶活性单位计算每毫升酶液中酶活性单位=测定OD/标准ODX标准管中酚含量X 1/0.1 X稀释倍数3.样品中蛋白质含量的测定(1)测定蛋白质时,保留的A’管还需稀释5倍为A’’管,否则蛋白质浓度太高,其余各管不需再稀释,各用1.0ml进行测定.表2A’’ B’ C’ D’ 空白各阶段稀释液(ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 -0.1mg/ml酚标准液(ml) - - - - 1.0pH8.8Tris缓冲液(ml) 5.0 5.0 5