细胞免疫荧光详细步骤.doc

细胞免疫荧光步骤 ? 【原理】 用特异性抗体（第一抗体）与细胞中的相应抗原反应，洗去未与抗原结合的抗体 再用荧光标记的第二抗体与结合在抗原上第一抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体复合物 由于荧光素在荧光显微镜下经过特定波长的光照摄激发后能发射出荧光，借此可对抗原定位和定量。 【材料】 培养细胞 【试剂】① 4%的多聚甲醛。 ② PBS (0.18M PH≌7.2) ：NaCl 18克， Na2HPO 4. 12H2O 12克，NaH2PO4,2H20 0.8克溶于2000m蒸馏水 。 ③ 封闭血清：与二抗同种来源属性的非免疫血清 。 ④ 第一抗体 ：xxx。 ⑤第二抗体：与一抗种属 Goat Anti-Mouse IgG (H+L),）。 ⑥??DAPI ： （碧云天 公司， Cat. C1006）染核。 ⑦ 抗荧光淬灭封片剂 : 碧云天 公司 Cat .PO126 【器材】? 冰箱 ， 载玻片?， 盖玻片（做正面标记），?? ?微量移液枪??，移液枪枪头??， 吸管?， 湿盒??， 指甲油?，?? DOCK 笔?， EP管??， 吸水纸??，???????六孔?板??? 摇床???? 振荡器-Triton ：?( PBS 99.5ml +0.5mlTriton?? 由于Triton比较粘，配前先在室温放会儿?,) ②10% 正常封闭血清??：?( 用 PBS-T 稀释 ，振荡器上振荡)。 ③0.3%-Tween ；用PBS稀释Tween。 ? 【步骤】?? 1???取出生长48小时的细胞爬片，移入一个干净的六孔板冷PBS浸泡不超过3分钟（事先在六孔板的第一排三个孔分别标记 )。 2? ?每个玻片滴加4%的多聚甲醛 冰上固定14分钟。 注意， 要水平，覆盖均匀。（准备封闭血清用? PBS-Triton??稀释 1:10 振荡器上振荡3 ???冷PBS,5分钟X2次? 摇床150rpm缓慢洗净 ，PBS-Triton透膜5min。（如果是胞浆，核或膜内表面表达需要这一步，如果是膜外表面表达的则不需要透膜） 4??? ?擦干爬片边缘， 用DOCK ?在爬片四周边沿 以防止爬片上所剂因失去张力流失，导致干片）。将爬片分别放入六孔板下排与上排标记相对应的孔内（该加封闭血清了 ，此时要求板是干燥的 ，下一排板没用过是干燥的）。5??????用微量移液枪?， 在每张爬片上加10% 正常封闭血清， 室温湿盒中阻断30 min。（ 准备一抗，用? PBS-Triton??稀释 抗体 1:100 振荡器上振荡??????一抗孵育：加已经稀释好的一抗，? 用微量移液枪小心加一抗，（逐个片去封闭液，擦干圈外水，加一抗 注意：不要碰细胞 ）置湿盒中，4o冰箱过夜，剩余的一抗保留。 7 . 次日，轻轻去盖，查看张力还在 。轻轻移至室温，湿盒内再孵育1 小时。 注意不干片 。 8?? PBS-Tween 洗 3次x5min （据情况适当变化）, 。?? 将爬片四周擦干? ，再将其分别放回六孔板上一排原先的孔内。（加二抗　，上一排板已干，所以再移回上一排板中）。. 避光处，加二抗???覆盖均匀? 平放 室温孵育一小时 （由于试剂会挥发，此间要查看，适当补加二抗避免干片）。 11 避光处,，PBS-Tween洗 3次X5min （据情况适当变化）, 轻轻的 。DAPI（一小滴）,室温孵育4min，PBS-Tween洗 13 避光处，待爬片晾干，往载玻片上滴加封片剂，爬片倒扣于封片剂上，用指甲油封爬片四周?? （防封片剂溢出并固定爬片)。 。 ?14 观察：?注意荧光强度随着灯光刺激衰减 ，注意：? 为了避免互相污染????? 从第3步开始 ，三个爬片滴加试剂的吸管