镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用2.docVIP

镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用 摘要：蛋白质纯化是进行基因工程中最重要的环节，选取纯化蛋白的工具对纯化结果影响巨大。镍离子亲和层析柱具有特异性高、纯度高、成本低、产量大等优点，镍离子亲和层析柱的国产化将极大促进蛋白质纯化产业的发展并会产生巨大的市场效益。 关键词：镍离子亲和层析柱、蛋白质纯化、国产化 亲和层析（Affinity chromatography，AC）是利用生物大分子和固定相表面的亲和配基之间可逆的特异性相互作用，进行选择性分离的一种液相层析分离方法。常用的亲和层析方式为金属螯合亲和层析,又称固定化金属离子亲和层析( Immobilized metal lchelated affinity chromatography, IMAC)，利用金属离子(Ni2+，Cu2+等)与氨基酸表面的残基(如组氨酸的咪唑基)的配位鳌合作用，来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。由于 IMAC 具有螯合介质制备简单方便，吸附容量大，选择性及通用性较好，易于再生，成本低等优点, 逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。镍离子亲和层析柱成为金属螯合亲和层析的代表产品。目前，国外有3-4家镍离子亲和层析柱产品在国内销售，但价格昂贵，国内已有数家公司开展了镍离子亲和层析柱产品的销售，其中，广州精达公司采用最新的镍离子亲和层析柱的制备技术，顺利完成了该种产品的国产化。 I、镍离子亲和层析柱的制备工艺 1、Ni2+吸附融合蛋白原理 Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有His（组蛋白）标签的碱性蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸（碱性氨基酸）。同时Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，利用咪唑梯度洗脱，从而获得纯度较高的融合蛋白。而利用基因工程技术制备的融合蛋白常携带6个组氨酸的标签，因6个组氨酸标签因肽片段小，故对目标蛋白质的生物活性影响较小，因此被广泛用于重组蛋白的制备及纯化。 2、固相载体的选择 常见的固相载体包括为普通琼脂糖颗粒及GE公司生产的Sepharose琼脂糖系列产品。普通的琼脂糖颗粒具有造价低，但结合蛋白不稳定，易造成镍离子脱落的重大缺点。而GE公司生产的Sepharose琼脂糖系列产品采用交联琼脂糖，具有高吸附力、高化学物理稳定性、快流速、强抗压力等特点，因此十分适合作为亲和层析柱中的固相载体。该系列包含有几类产品包括：Sepharose 4B、Sepharose 6B、Sepharose 4FF、Sepharose 6FF等。实验发现Sepharose 4B的空间位阻效应较小，可结合较大量的蛋白质，而且还克服了Sepharose 6B流速慢的缺点，在蛋白质纯化中能够得到相同的结果，因此，采用Sepharose 4B成为当前较好的选择。 3、配基的选择 常见的配基包括次氮基三乙酸Nitrilotriacetic acid，NTA）及亚氨基二乙酸Iminodiacetic Acid，IDA）。NTA中的一个氮原子、三个氧原子与金属离子结合后，金属离子空余两个空轨道与蛋白质结合。而IDA则是一个氮原子、两个氧原子与金属离子结合，金属离子空余三个空轨道与蛋白质结合。因此，IDA具有更高的蛋白质结合能力，利用IDA具备的镍离子金属亲和层析柱具有更高吸附蛋白质的能力，因而被广泛运用。 II、广州精达公司镍离子亲和层析柱 镍离子亲和层析柱在纯化蛋白中用量大，运用范围广，相较于价格较高的国外产品，生产价格便宜且性能更为良好的国内产品成为当前迫切需要解决的问题。 广州精达医学科技有限公司是由美国免疫学博士胡勇创立的生物医药公司。公司制备镍离子亲和层析柱选购国外原材料，同时采用全套的美国生产工艺（图1），同时采用先进的偶联技术，降低生产成本，具备大规模产业化资质。 图1 采用先进的化学偶联技术，将镍离子与琼脂糖Sepharose 4B进行结合，同时连接IDA配基结合镍离子，制备成镍离子亲和层析柱（Ni2+-IDA）。用户在使用层析柱时，粗蛋白样品中目的融合蛋白与镍离子特异性结合，其他杂蛋白因为不能与镍离子结合而穿过层析柱。结合在柱子上的融合蛋白可以用梯度咪唑进行洗脱使之解离，用收集管编号收集以达到纯化蛋白质的目的。一般管中收集的融合蛋白用蛋白胶（SDS）进行检测，并判断蛋白的纯度及浓度。 图2显示的为广州精达公司镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白的效果图（SDS电泳胶）。根据图中显示，经精达公司层析柱洗脱后，纯化的融合蛋白纯度高、杂蛋白含量低，纯化效果良好。 广州精达公司镍离子亲和层析凝胶及亲和层析柱产品可参见图3。 融合蛋白的纯化对基因工程后续实验具有十分重要的意义，包括获得单一活性蛋白质用于产品生产，或用于制备抗原，纯度越高的抗原所获得的抗体纯度越高，高质量的抗体又