第三章高效液相色谱1课题.ppt

第三章 高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography 本章内容： 高效液相色谱概述 高效液相色谱仪 高效液相色谱的分类 高效液相色谱分析方法 高效液相色谱仪的维护与保养 高效液相色谱商品仪器及厂商 一、概述 概念 特点 应用 高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)一般指采用高压输液泵、高效分离柱、高灵敏检测器等仪器装置，具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广的一类液相色谱分析方法。 高效液相色谱和经典液相色谱的比较 色谱柱 流动相的 推动力 检测方式 高效液相色谱适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和天然产物；合成和高分子化合物，以及无机和有机离子型化合物。 在生命科学领域的应用 氨基酸、多肽、蛋白质，核碱、核苷、核苷酸、核酸（RNA、DNA）等生命物质的纯化和分析。 药物分析 合成药物的纯化及质量控制，中草药有效成分的分离、制备及纯度测定以及临床医学的药代动力学研究中的分离分析。除聚合物外, 约80%的药物都能用高效液相色谱进行分离和纯化。特别是手性药物的分离分析 。 食品分析 ①食品本身组成, 特别是营养成分，如糖、有机酸、维生素、蛋白质、氨基酸、脂肪的分析； ②食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜化学物质的分析； ③食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分析 环境监测 该法特别使用于分子量大, 挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析。如多环芳烃、酚类、多氯联苯、邻苯二甲酸酯类、联苯胺类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药等。 精细化工产品分析 具有较高分子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种表面活性剂、药物、农药、染料、炸药等化工产品 制备分离应用 在许多科学研究和生产领域，往往需要制备或提取一些高纯化合物。 流动相脱气装置 高压输液系统： 高压泵要求： 泵体材料能耐化学腐蚀。 能在高压下连续工作。通常要求耐压40～50MPa·cm-2。 输出流量范围宽。一般为0.1～10mL/min。 输出流量稳定，重复性高。流量控制的精密度应小于1% 等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 梯度洗脱 梯度洗脱指采用两种（或多种）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续变化流动相组成比和极性的一种洗脱模式。对于复杂混合物，特别是保留性能相差较大的混合物的分离梯度洗脱是一种极为重要的手段。 特点 （1）改善分离, 加快分析速度；（2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕量组分的检测 进样系统：不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱 分离系统：色谱柱 包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm 以上。 操作注意： 流动相的转换 流速的变化幅度 温度变化幅度 专用色谱柱：样品及溶剂的要求 检测器：利用被测物的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当被测物从色谱柱上流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰形式表现出来。 紫外吸收检测器（UV-VIS）具有灵敏度高，线性范围宽，对流动相基本无响应，对流速和温度不敏感等特点，它是液相色谱最常用的检测器。 紫外光度检测器光路图： 紫外检测的主要参数是选择检测波长 应考虑溶质和流动相的吸收特性： 常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其他目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长； 应尽可能选择检测波长下没有背景吸收的流动相 光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。 示差折光检测器（refractive index，RX） 除紫外检测器之外应用最多的检测器。通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。折射率是物质的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器 折射率对温度的变化非常灵敏，检测器必须恒温 灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。 荧光检测器（fluorescence detector，FLD） 它用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光体。可用荧光检测的物质：如某些代谢物、食品、药物、氨基酸、多肽、胺类、维生