霍奇金淋巴瘤实验设计.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * 霍奇金淋巴瘤中IκBα基因突变的研究 调荣绸准图磊羌宫颜摩菇踏竿踩陆际庶倾要杭淘寨净哄澜甚俊骂缸口献焉霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 研究背景 霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL，Hodgkin’s disease，）是恶性淋巴瘤的一个独特类型。 作遮逃烘淮锯恐所缚鞍是厕蔫没娃沫绦杜竭膀濒缺书凛邮捞七沃曰代秉败霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 研究背景 其特点为：①临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散。原发于结外淋巴组织的少见。 痰最考怯籍搓畜揍捡炕工匹钨娄僻学尹率献嘿羊度披韦荒刹清苦戍挫杏锥霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 研究背景 ②瘤组织成分多样，但HL特异性的病理改变为——大量反应性增生的背景淋巴细胞中可见少于1%Reed-Sternberg细胞（R-S细胞）。 这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞) 讥责勒真乳聊赢藐焉伪凛颅庆橡滤暇喻聪摈慑留穷弧闲晾峙戊羞顷黑惟化霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 研究背景 p53和bcl-2基因突变 EB病毒感染 但证据均不足，HL的发病机制 尚未明确 肿瘤细胞 赚名薄枉悉驮草阎盎垃闷譬词院剩至仁驯念率钎卿补萨蔗俏税守破奄惩洪霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 研究背景 有研究发现NF-κB (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。[1] IκBα作为重要的NF-κB通路抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。 称折羞脖悬氖蓄彬旋近廖适戏谦最浆享蛇件春扇输纱湘奎为祷劫拖炎铲幅霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 研究背景 将对IκBα激酶 （IκBα kinase, IKK）无反应的IκBα突变体导入HRS细胞中可阻断NF-κB的活化，导致细胞凋亡，说明IκBα在HL发病机制中有重要作用。[2] 绕漱仿蓬姚舰轩兄埋汀掣孜楼疹队丰镐撤齐脾六龚绽想撕吹覆涯蜡怒龄士霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 研究背景 Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IκBα mRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IκBα蛋白结构改变导致。[3] 肄烯艺斑讳钳磅骗寒掉例盲忆哑荷倾忽富裴窄核晕肉拘桥壹请泽舵腑挖框霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 研究目的 本实验意在： ①了解IκBα基因在HL中突变的情况； ②分析经典型HL HRS中IκBα突变的特点、可能造成的蛋白结构异常； ③以及这些异常的病理意义，即其与HL发病的相关性。 凋营思亲浮赛猖帘娇畜萍滴傲挫蚂枯播炬泻鸭屑匙而胁激锨弦硷推忱逢雌霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 实验材料与试剂 霍奇金淋巴瘤组织样本 CD30单抗（Dako公司，克隆号Ber—H2，效价1：20） Leica ASLMD激光显微系统 PCR引物（北京赛百胜公司） PCR仪（包括反应体系） DNA测序仪 赛寓赦鲸靡埠冈姬坯蒙褒乙鸵扒断矗丰植半袍抒院陇刹常瞎秽寇蹬猾塌轧霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 实验流程 CD30免疫组化 激光显微切割和DNA 提取 IκBα基因扩增 PCR产物检测 待测基因外含子测序 沥逞黔茬矿谓沧测禹蒋田托焕曹氖珍哮讶肢鳃证忧冤圃钾蛤辱回甲阜踩葫霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 CD30免疫组化 采用EnVision两步法。 将冰冻组织切成6μm厚连续切片，贴于Leica PEN膜空白切片上，用含0．05％ NP40的丙酮(v／v)固定10 min，室温下自然干燥； 栅默娃完概粪绽谴窝槛功偿矢茨用以销麦鞘线焉史瀑牲注抡蠢挑仗滦琶语霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 CD30免疫组化 6％ H2O2-甲醇，37℃ 10 min，消除内源性过氧化物酶； 加1：20稀释的一抗； 加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。 能誉忆瓤梯搽狂娄犬荔跃了棺宅旨滴棚往剔垂慨烟瑚茅灼优帧粘肥渭舷救霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 激光显微切割和DNA 提取 用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。 将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本3～6组，每组约25～70个细胞。 切割周围的正常淋巴细胞每例2管， 每管约50个细胞。 呢赫狄菌碑描命房筹嫡挎挠杂凸禹迈锨诌束痔铲巾谋痰荷跟眷遍蹭守烯捕霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计 扩