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色谱分离理论 基本分离方程的推导 （1）理论塔板数 （2）容量因子 （3）分离因子 多组分分离 分离速度 色谱柱峰容量 多元化合物色谱分离的优化指标 * 如何评价色谱分离的好坏？或者说色谱分析追求的目标什么？ 分离度、分析时间、样品量？ 优化色谱分离的目标是实现混合物的完全分离，涉及到各组分色谱峰之间的相互关系，是一个与热力学和动力学有关的综合性问题。因此文献上提出许多不同的多元混合物色谱分离的优化指标。 Sig time Sig time Sig time 在色谱中相邻两组分(“物质对”)的分离度： ●热力学：保留值的差别要足够大 ●动力学：色谱峰要足够窄 R是色谱中两个组分分离好坏程度的标志。从色谱分析的角度看，只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。在色谱分析中, 并不是要求R越大越好, 而是追求最佳分离。 对于复杂样品的分析，所有待测组分的分辨率要足够大（ R 2），才能满足定量分析的要求，同时分离过程要尽可能短，保证痕量分析的灵敏度。这就是色谱优化理论。 对于一个具体的色谱分离，R值应该多大？ R作为相邻色谱峰重叠程度的量度, 有如下两种情况： ① 等高峰 ② 不等高峰 要注意防止“交叉污染”。如h1：h2 = 10 : 1，R = 1.0，A2的纯度由97.72 %降低为88 %。 84.1 2 ? 0.5 94.5 3.2? 0.8 97.72 4? 1.0 基线分离 99.87 6? 1.5 备注 峰纯度(%) tr(2)－tr(1) R Snyder Kirkland 标准分离曲线： 峰高比1：1~128：1，R为0.4~1.25的分离图 通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。 实际工作R要多少？ 补充材料 对于多组分混合物的分离分析, 通常特别关注最难分离的相邻的色谱峰, 即物质对的分离。由于它们的保留值差别较小, 可合理认为（!）, W1 = W2 = W , 则 （1） （2） （3） 柱效因子 相对分离因子 保留程度因子 分辨率公式： 上式没有直接给出分辨率与色谱基本参数k和N的关系。 初始 图8. k、N、?对分离的影响 增大k 增大N t 改变? S t ● 当固定相确定以后, 要使一对组分的分离达到某一个R值, 柱必须具有最低限度的理论塔板数，即最低柱效。(初步实验有人常采用“旧”柱子？？？) ● 增加N值也可改进分离度, 这意味着选择一根性能优良的色谱柱, 并在最佳化条件下操作。 如何提高色谱柱的柱效？ ● 增加柱长可以改进分离。但是柱长增加（同时压力增大）, 分析时间也随之增加, 峰宽也随保留时间延长而增加, 因此, 单纯追求长柱不可取。 常规GC和HPLC柱长是多少？为什么？ 在等温条件下, 对给定色谱柱, k和?为常数, 分离度决定于理论塔板数。使两组分达到某一分离度所需的塔板数, 可由下式计算： （a）两色谱峰距离近并且峰形宽。两峰严重相叠，这表示选择性和柱效都很差。 （b）虽然两峰距离拉开了，但峰形仍很宽，说明选择性好，但技效低。（c）分离最理想，说明选择性好，柱效也高。。 补充材料 可见，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况，故需引人一个综合性指标——分离度R。分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标，分离度又叫分辨率。 则分离方程式为 令： 根据 tr = t0 (1＋k) ，图中前段时间曲线与事实不符！ 补充材料 0.98 0.97 0.91 0.89 0.83 0.75 0.50 0.33 k/(1+k) 50 30 10 8.0 5.0 3.0 1.0 0.5 k 即固定相已选定, 即?已定, 为了达到良好分离，适当增大k有利于分离。这体现在两方面： ● 柱长一定, 在给定操作条件下, N值一定, 此时k越大, k/(1＋k)也越大, R越大。 ● 分离度一定, 如R = 1.5, k越大, 达到该分离度所需的N值越小, 即所需柱子越短。但是k不是越大越有利。观察以下数据： 可见, 过大的k(10), 使k/(1+k)的改变不大, 对R的改进不明显, 反而使保留时间大为延长。 使k改变的方法有： ● 改变柱温（如GC） ● 改变流动相性质和组成(在LC中) ● 改变相比 0.98 0.97 0.91 0.89 0.83 0.75 0.50 0.33 k/(1+k) 50 30 10 8.0 5.0 3.0