a型流感嗜血杆菌结合物游离多糖含量测定方法研究.docVIP

a型流感嗜血杆菌结合物游离多糖含量测定方法研究 　　流感嗜血杆菌包括可分型流感嗜血杆菌和不可分型流感嗜血杆菌，其中可分型流感嗜血杆菌根据荚膜多糖的结构又分为a～f6个血清型。接种b型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzaetypeb，Hib)结合疫苗的所有国家，侵袭性Hib疾病的发病率降低了90%以上，而Hia的发病率明显升高。Hia与Hib疾病类似，死亡率高，后遗症严重。目前北美本土人群Hia发病率全球最高，1988～2003年，美国西南地区5岁以内儿童年平均发病率为20.2/10万。2003～2011年，美国阿拉斯加共发生两次侵袭性Hia疾病暴发流行。借鉴Hib多糖蛋白质结合疫苗的成功经验，部分学者认为迫切需要制备Hia结合疫苗。 　　结合疫苗的游离多糖含量是质量控制的重要指标之一，有研究显示，结合物的游离多糖含量与其免疫原性密切相关，游离多糖含量超过10%时，会降低结合物的免疫原性，因此，需要对结合物的游离多糖含量进行准确定量。 　　载体蛋白质对结合疫苗结合化学的选择起重要作用，结合过程中可以选用载体蛋白质的羧基作为结合位点，也可选择氨基作为结合位点。对于TT，在甲醛脱毒的过程中会封闭一定量的氨基基团，反应不易控制，从而导致不同批次TT的氨基含量差异较大。某些情况下可衍生载体蛋白质，包括ADH衍生，从而获得活性更强的肼基基团;也可用琥珀酸酐进行衍生，在氨基上连接琥珀酸基团以降低结合反应过程中蛋白质聚合。不同类型载体蛋白质的表面电荷分布有较大差异，导致制备的结合物在电荷分布上也存在较大差异，因此，应摸索一种适用于不同电荷分布的结合物的游离多糖含量测定方法。本实验拟建立脱氧胆酸钠(NaDC)盐酸法结合蒽酮硫酸法，以适用于检测破伤风类毒素(tetanustoxoid，TT)、TTADH衍生物(ADHderivativeofTT，TTAH)、TT琥珀酰化衍生物(succinicanhydridederi-vativeofTT，TTSA)3种带有不同电荷的载体制备的Hia结合物的游离多糖含量。 　　1材料与方法 　　1.1样品Hia多糖降解物[荚膜多糖降解产物(depolymerizedpolysaccharide，de-PS)、批号：试De-201505003)]、Hia多糖衍生物[多糖降解物ADH衍生物(ADHderivativeofde-PS，de-PSAH)、批号：试HD-201506003)]、TT(批号：试HP-201209002)、TTAH(批号：试HD-201504003)、TTSA(批号：试HD-2015-08003)均由本公司第一研究室制备，其中Hia生产用菌株HK643由丹麦奥胡斯大学Dr.Kilian教授惠赠。本实验使用的TTAH和TTSA均由TT(试HP-201209002)衍生制备。衍生物及结合物均由本公司第一研究室制备，多糖衍生物：多糖降解物经CDAP活化后，与ADH一端的肼基连接制备;结合物(2015-06001和201508006)：EDAC缩合多糖衍生物的肼基与TT或TTSA的羧基共价结合制备;结合物(2015-06002和201506003)：CDAP活化多糖降解物后直接与TT或TTAH共价结合制备。 　　1.2主要试剂葡萄糖、蒽酮和NaDC均购自美国Sigma公司;盐酸、硫酸购自白银良友化学试剂有限公司。 　　1.3蛋白质含量测定参照《中国药典》三部(2010版) Lowry法测定蛋白质含量。 　　1.4多糖含量测定参照《中国药典》三部(2010版)蒽酮硫酸法测定多糖含量。 　　1.5游离多糖含量的检测采用NaDC盐酸法，具体参考文献]进行。将100mu;l1%NaDC(pH7.3)加入1ml待检样品中，振荡混匀，于2~8℃静置30min;加入50mu;l1mol/LHC1，振荡混匀，4℃，20000times;g离心30min;取1ml上清，采用蒽酮硫酸法测定上清多糖含量。 　　1.6Hia结合物游离多糖含量测定方法的建立 　　1.6.1NaDC盐酸法对蒽酮硫酸法测定多糖含量的影响将葡萄糖标准品配制成0、10、20、30、40、50mu;g/ml浓度，按1.4项方法进行检测，绘制标准曲线1，计算相关系数(r2)。将葡萄糖标准品配制成0、11.5、23、34.5、46、57.5mu;g/ml浓度，按1.5项方法进行检测，此时，葡萄糖标准品的最终浓度与标准曲线1一致，绘制曲线2，计算r2。 　　1.6.2NaDC盐酸法沉淀TT、TTAH和TTSA最大能力的确定将TT溶液稀释至50、100、150、200、300、400、500、600和700mu;g/ml，TTAH溶液稀释至50、100、150、200、250、300、350、4