土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定.docVIP

微生物综合实验报告 土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选 及淀粉酶活力的测定 学院：生命科学学院 班级：生物技术121班 姓名： 学号： 摘要 本次实验选取广大的土壤，使用五点法采样，并制备出土壤悬液。然后将土壤悬液的上清液分四个梯度稀释，使用平板划线法反复进行分离纯化，得到纯净的菌株。我们得到菌株后，采用形态学的辨别方法，单染色，芽孢染色，革兰氏染色，淀粉水解实验，温度 实验，糖类发酵试验（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇），VP试验，MR试验，吲哚试验，柠檬酸盐利用实验，耐盐性试验，硝酸盐还原实验，明胶液化试验，运动性穿刺试验，酪素水解试验，卵黄实验等方法检验，查阅伯杰氏手册后，鉴别其为蜂房芽孢杆菌。 二，材料与方法 1 材料 1.1 试剂 碘原液：碘1lg，碘化钾22g，加水定容至50OmL； 单染色：草酸铵结晶紫或石炭酸复红； 革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。 芽孢染色：5%孔雀绿染色液，0.5%沙黄染色液。 V.P试验：40%NaOH 溶液，ɑ-奈酚。 吲哚试验：乙醚，吲哚试剂。 硝酸盐试验：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL；乙液（α-奈胺0.5g + 5mol/醋酸100mL）； 酪素水解：牛奶； 酪氨酸水解：L-酪氨酸； 淀粉酶活力测定：1% 3,5-二硝基水杨酸试剂。 1.2仪器： 无菌培养皿，接种环，土样，三角瓶，烧杯，试管，酒精灯，无菌吸管，载玻片，吸水纸等。恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台，水浴箱，磁力搅拌器，涂布器，显微镜，移液管，移液枪。 1.3 培养基 筛选及活化培养基 淀粉20 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，琼脂10 g，自来水1000 ml, pH 自然。 斜面种子培养基 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4； 摇瓶发酵培养基 称取可溶性淀粉2 g，蛋白胨1 g，牛肉膏0．3 g，氯化钠0．5 g溶于100 mL蒸馏水中。pH自然； 蛋白胨液体培养基（作吲哚实验用） 蛋白胨10 g，NaCl 5 g，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4，121℃ 灭菌20 min； 葡萄糖蛋白胨培养基（VP和MR试验用） 蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4，121℃ 灭菌20 min； 糖发酵培养基（作细菌糖发酵试验用） 蛋白胨2 g，NaCl 5 g，K2HPO4 0.2 g，1%溴麝香草酚蓝水溶液3 ml，待试糖10 g(一般糖或醇按1 % 量加入，而半乳糖、乳糖按1.5 % 的量加入)，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4； 酪氨酸平板（作酪氨酸水解试验用） L－酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中，20分钟灭菌，然后于100mL无菌的营养琼脂混合，即成酪氨酸水解平板； 酪素平板（作酪素水解试验用） 取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板； 西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（作柠檬酸盐利用试验用） 柠檬酸钠2 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H20 0.2 g, K2HPO4·3H20 1 g,(NH4)2HPO4 1 g, 1%溴麝香草酚蓝水溶液10 ml，琼脂15～20 g，自来水1000 ml，pH 7.0 , 121℃ 灭菌20 min； 淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 可溶性淀粉2 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2～7.4； （2%、5%、7%）高盐培养基 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl（ 2g、5g、7g），琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2～7.4； 明胶培养基 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，明胶12g，蒸馏水1000 mL ，pH 7.0； 半固体培养基（作运动性实验用） 琼脂含量0.5%，其他组分比例按牛肉膏蛋白胨培养基配制； 2 方法 2.1 土样的采集 选取广大梅苑公寓楼下花园、广大生化楼前小河附近两处的土壤，五点法采集，边长15cm。铲去表层土，取10cm深土壤，每一个土样约25g 左右（每个点5g）。将土样放入无菌的纸袋中,并记录采集的时间、地点、植被类型,4 ℃保存备用。 2.2 土壤样品悬液制备 2.2.1 土壤悬液制备 各称取5 g 土壤样品于装有45ml 无菌水的100ml锥形瓶中，加入玻璃珠与土壤悬液一起振荡, 制成土壤悬液。置100