植物生理实验过氧化物酶的活性.docVIP

班级：11级生科2班 组员：XX XXX 题目：过氧化物酶活性的测定 过氧化物酶（POD）在植物体内普遍存在，是活性较高的一种酶， 与植物代谢作用和抗逆性等都有一定关系。其主要生理功能： 参与活性氧代谢过程 参与木质素和木栓质的合成 参与生长素的降解 【实验原理】 在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2 将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470 nm 处有最大光吸收值，故可通过测470 nm 下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。 【材料、设备与试剂】 1. 材料：植物叶片或其它任何植物材料。 2. 仪器设备：分光光度计；低速冷冻离心机（配套的离心管）； 恒温水浴锅；微波炉；研钵；容量瓶；移液管；试管；洗耳球等。 3. 试剂及配制：0.2 mol·L－1 磷酸缓冲液（pH6）反应液（100 ml 0.2 mol·L－1 磷酸缓冲液中加入0.5 ml 愈创木酚、1 ml 30% H2O2，充分摇匀。最好在使用前配制。） 【方法与步骤】 1. 酶液提取：称取植物叶片 0.2 g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为5 ml pH6 磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在4000 r/min 离心15 min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。 2. 酶活性测定：吸取反应液3 ml 于试管中，加入酶提取液0.1 ml，迅速摇匀后倒入光径1 cm 的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470 nm 波长处，测定OD 值。每隔1 min 记录1 次吸光值，共记录5 次。 3. 结果计算：按下式计算酶的相对活性。 取相对稳定的每分钟吸光度变化值（Δ A 470），代入下式计算出过氧化物酶的活性，即用每min 内OD 变化0.01 为1 个过氧化物酶活力单位（U） 酶活性（U·g-1·min-1）=（△A470×Vt）/W×Vs×0.01×t 式中： Δ A 470 ——反应时间内吸光度的变化值。 W ——植物鲜重，g 。V t ——提取酶液总体积，mL 。 V s ——测定时取用酶液体积，mL 。 t ——反应时间，min 。 记录实验结果 1min OD值 2min OD值 3min OD值 4min OD值 5min OD值 6min OD值 △A470 完 全 0.177 0.588 0.988 1.349 1.682 1.997 0.365 缺P 0.419 0.785 1.137 1.463 1.763 2.038 0.326 缺N 1.362 1.653 1.855 2.032 2.201 2.351 0.183 缺Fe 0.294 0.411 0.499 0.583 0.659 0.737 0.083 缺Mg 1.130 1.976 2.670 3.010 3.010 3.010 0.517 缺K 0.129 0.561 1.041 1.496 1.930 2.345 0.456 数据处理： △A470的计算方法：分别用后1min的OD值减去前1min的OD值，然后去掉第一个和最后一个差值，剩余3个差值求平均值。 1. 完全 酶活性（U·g-1·min-1）=（△A470×Vt）/W×Vs×0.01×t =[（0.365×5）/0.2×0.1×0.01×5] （U·g-1·min-1） =0.0456（U·g-1·min-1） 2. 缺P 酶活性（U·g-1·min-1）=（△A470×Vt）/W×Vs×0.01×t =[（0.326×5）/0.2×0.1×0.01×5] （U·g-1·min-1） =0.0408（U·g-1·min-1） 3. 缺N 酶活性（U·g-1·min-1）=（△A470×Vt）/W×Vs×0.01×t =[（0.183×5）/0.2×0.1×0.01×5] （U·g-1·min-1） =0.0228（U·g-1·min-1） 4. 缺Fe 酶活性（U·g-1·min-1）=（△A470×Vt）/W×Vs×0.01×t =[（0.083×5）/0.2×0.1×0.01×5] （U·g-1·min-1） =0.0103（U·g-1·min-1） 5. 缺Mg 酶活性（U·g-1·min-1）=（△A470×Vt）/W×Vs×0.01×t =[（0.5