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iTRAQ定量分析蛋白质组学 iTRAQ定量分析蛋白质组学 iTRAQ定量蛋白质组学简介 iTRAQ试剂标记原理 iTRAQ技术优势 iTRAQ实验技术流程 iTRAQ实验结果示例 iTRAQ实验详细实验步骤 iTRAQ简介 iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114～121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。 iTRAQ试剂标记原理 iTRAQ技术优势 1：灵敏度高，检测限低，可检测出低丰度蛋白； 2：分离能力强,分析范围广,iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。 3: 高通量：同时对8个样本进行分析，提高了实验通量，可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析； 4：结果可靠：定性与定量分析结果更加可靠； 5：自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。 iTRAQ实验技术流程 iTRAQ实验结果示例 iTRAQ详细实验步骤—ABI试剂盒 iTRAQ详细实验步骤 1：蛋白质提取 可以选取各种提取蛋白质的常规溶液，裂解液里最好不要包括下面试剂，因为这些试剂会干扰iTRAQ试剂标记反应。 iTRAQ详细实验步骤 2：蛋白质定量 2.1：可以采用Bradford方法及其他方法定量初步定量 2.2：取各组相同蛋白质SDS-APGE电泳，银染定量，根据每个涌道染色情况调整，使每组样本量相同。 iTRAQ详细实验步骤 3：酶切，标记 （1）每组样本（各100ug）分别加入-20度预冷的丙酮（丙酮：样品体积比=6：1），颠倒混匀，-20度沉淀30分钟-4小时（根据样品所需沉淀量选择时间，一般开始时可选1小时）； （2）12000rpm 离心15分钟，弃上清，用试剂盒中自带的溶解液dissolution buffer（20uL） 和1% SDS(1ul)充分混悬溶解样品； （3）加入还原试剂2ul，混匀，60度反应1小时； （4）加入半胱氨酸封闭试剂（cystine blocking regent）1ul,室温处理10分钟； （5）按照酶：蛋白质=1：20的比例加入trypsin酶,37℃酶解过夜（16h）； (6)113,114,115,116,117,118,119,121各管标记试剂中加入50uL 异丙醇(试剂盒中自带），混匀，分别加入各管样品中，室温反应一小时，之后各加入三倍体积水，使标记试剂分解。标记和样品对应关系如下:4R—117,未知—118，BOO6—119,11R—121； (7)合并各管标记好的样品，真空冷冻干燥。 iTRAQ详细实验步骤 4：除盐，此步操作是将标记过程中的标记试剂和相关buffer的盐除去，以便于后续分析。 （1）100%乙腈冲洗柱子3次 （2）0.1%TFA(水溶),冲洗柱子三次 （3）用400uL 0.1%TFA溶解样品，加载到柱子上 （4）0.1%TFA 冲洗柱子3-5次 （5）用50%乙腈 0.1%TFA400uL 洗脱下样品 （6）将样品冷冻干燥后进行后续分析。 iTRAQ详细实验步骤 第一维强阳离子柱(SCX)分离 （1）6.1仪器及试剂：1）色谱仪20AD（岛津），2）真空离心浓缩机rotation vacuum concentrators（Christ RVC 2-25，Christ，Germany），3）磷酸二氢钾（国药集团），4) 氯化钾（国药集团），5) 乙腈ACN(Fisher) （2）具体操作参数 柱子信息：Polysulfoethyl column,2.1mm*100mm,5u,200A, The Nest Group,Inc.MA A相：10mM KH2PO4，25% CAN，PH 2.6 B相：10mM KH2PO4，350mM KCl，25%ACN，PH 2.6 紫外检测波长：214nm/280nm 流速：200uL/min 梯度：60min， B%从5分钟5%到40分钟上升至25% Time(min) B% 0 0 5 5 40 25 45 80 50 80 51 0