氨基酸分析法对蛋白定量的初步分析.docVIP

氨基酸分析法对蛋白定量的初步分析 　　近年来，生物技术药物发展迅速，在疾病的预防、诊断及治疗中发挥着重要作用，而重组蛋白类药物在生物技术药物中占有较大比重。蛋白质含量测定是重组蛋白类药物质量控制中的重要指标之一，准确的蛋白质含量测定对产品的分装、比活性计算、残留杂质的限量控制以及其他理化特性测定均具有重要意义。而蛋白含量测定标准品作为蛋白含量测定中的“标准”或“尺子”，其本身的准确定量十分重要。 　　现行的蛋白含量测定国家标准品用于Lowry法或其他方法测定蛋白含量，其按《中国药典》三部(2010版)、WHO、ICH标准品有关要求进行制备、分装、冻干、质量检测，并开展了协作标定。该标准品经检定，分装精度(分装误差lt;1%)、外观、无菌、水分(0.7%)均符合要求，并经多家实验室进行凯氏定氮协作标定，结果为19.83mg/支。氨基酸分析是通过强酸或强碱破坏蛋白质中的肽键，进而使蛋白质水解为氨基酸的过程。再通过对组成蛋白质的各个氨基酸的分析进而实现对蛋白质的组成或定量分析。国外已有实验室应用氨基酸分析的方法对标准物质进行定量，本实验旨在利用氨基酸分析的方法对蛋白含量测定国家标准品进行蛋白含量测定，并与凯氏定氮的结果进行比较，以探讨氨基酸分析的方法用于该标准品或直接对其他重组蛋白定量的可行性。 　　1材料与方法 　　1.1标准品蛋白含量国家标准品，批号：(2005)国生标字0009，为本室保存。 　　1.2主要试剂及仪器17种氨基酸标准溶液购自日本Ajinomoto公司;其他常用试剂均为国产分析纯;L8800型氨基酸分析仪购自日本Hitachi公司;旋转蒸发仪(型号为RE-52AA)购自上海亚荣生化仪器厂。 　　1.3氨基酸组成分析 　　1.3.117种氨基酸标准溶液的配制取标准溶液2ml，用0.02mol/L的盐酸稀释，容量瓶定容至50ml。将配制好的溶液作为样品氨基酸组成分析的标准溶液，在进样的20mu;l中含脯氨酸4nmol，其他16种氨基酸2nmol。 　　1.3.2系统的适用性验证色谱条件：用L8800型氨基酸组成分析仪进行分析，交换柱为46mmtimes;60mm，填料为3m的磺酸型阳离子交换树脂;柱温：57℃，反应器温度：135℃，柠檬酸钠缓冲液梯度洗脱，流速：0.4ml/min。各流动相的配制及洗脱程序均按照氨基酸分析的标准程序进行。取上述配制好的标准溶液，每针进样20mu;l，连续进样3针，计算各组分峰面积及保留时间的相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)，考察系统的稳定性。 　　1.3.3蛋白含量国家标准品最佳水解时间的考察分别精密称取蛋白含量国家标准品5.4、5.1、5.7、5.7mg，加入氨基酸水解管中，加入6mol/L的盐酸溶液5ml，充氮，密封。在110℃条件下分别水解16、20、24、28h。水解后的样品全部转移至旋转蒸发仪进行旋蒸，干燥后的样品精确加入5ml水溶解，过0.45mu;m滤膜后上机备用。按照1.3.2项方法进行氨基酸组成分析，并计算回收率，考察蛋白含量国家标准品的最佳水解时间。 　　1.3.4蛋白含量国家标准品的氨基酸组成分析取蛋白含量国家标准品7支，从每一支标准品中精密量取人血白蛋白(humanserumalbumin，HSA)约5mg，分别加入氨基酸水解管中，加入6mol/L的盐酸溶液5ml，充氮，密封。在110℃条件下，按照1.3.3项中确定的最佳水解时间进行水解。水解后的样品全部转移至旋转蒸发仪进行旋蒸。干燥后的样品精确加入5ml水溶解，过0.45mu;m滤膜后上机备用。按照1.3.2项方法进行氨基酸组成分析，样品每针进样10mu;l。并计算RSD、变异系数(CV)及回收率，验证方法的精密性及准确性。 　　1.3.5数据处理将机器自动分析得到的各氨基酸含量(即10mu;l样品中含有的ng数)按照样品浓度转化为100mg样品中的mg数(如精密称量的样品质量为5.1mg，干燥后精确加入5ml水溶解，则样品浓度为：5.1mg/5ml=102mg/100ml，氨基酸分析测得的天门冬氨酸为939.64ng/10mu;l，则样品中天门冬氨酸含量为8.70mg/100mg)。通过对7支样品的测定，得到每种氨基酸测得结果的平均值，对测得的17种氨基酸的量进行加和，即可算出100mg样品中测得的样品mg数，进而计算出氨基酸分析仪测得的蛋白含量为实际称量的蛋白含量的百分数。另取蛋白含量国家标准品5支，按《中国药典》三部(2010版)“装量差异”法要求，计算其平均装量，与上述氨基酸分析得到的百分数相乘，即为蛋白含量值。 　　2结果 　　2.1系统的适用性试验结果显示，连续进样3针系统对各氨基酸组分均有良好的分