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浅谈牙本质屏障细胞毒性试验的研究进展 　　评价口腔材料生物相容性的主要手段分为体外试验、动物试验和临床试验。尽管体外试验的临床相关性较其他两种方法略为不足，然而其具有简便、快捷且可以避免对动物和人体的伤害等优点，因此实际应用较为普遍。口腔材料的体外细胞毒性试验方法分为三类，即浸提液试验、直接接触试验和间接接触试验。牙体充填材料主要使用浸提液试验和间接接触试验。其中浸提液试验中的MTT法、XTT 法、中性红摄取法等试验可定量测定细胞毒性，间接接触试验中常用的琼脂扩散法和滤膜扩散法属于定性评价材料的细胞毒性。尽管上述方法已普遍用于口腔材料生物相容性的检测，然而许多研究表明，传统的体外试验中细胞的反应与体内试验中牙髓细胞的反应之间的相关性较低，此差异与牙本质的结构和牙髓细胞在体内的特殊生长环境有关。因牙体充填材料与人体的接触方式特殊，即在材料与牙髓细胞之间有牙本质的分隔，有学者于上世纪八十年代提出了一种专门适用于牙体充填材料的利用牙本质为屏障的体外细胞毒性试验，且发现其结果与临床实际情况有很好的相关性。经过不同学者长期的试验与研究，试验方法有很大改进，试验装置也发展为固定模型。目前应用的牙本质屏障法模拟了牙体充填材料充填入牙体后与牙本质接触的过程，材料及其可滤沥成分通过牙本质小管渗透到牙本质下方的细胞并与其接触，定量分析细胞的存活从而判定材料的细胞毒性[1]。与其他体外细胞毒性试验相比，此法更好地模拟了临床实际情况，具有替代动物试验( 如牙髓牙本质试验) 的可能性，更加适合用于评价牙体充填材料以及与牙本质直接接触材料的细胞毒性。此法在2008 年被国际化标准组织ISO列入牙科医疗器械生物相容性评价国际标准的资料性附录B 中，并已广泛应用于相关材料的毒性研究。由于在细胞培养、试验装置和牙本质的通透性方面仍有许多有待完善的部分，此法还不是常规使用的细胞毒性试验方法，目前国内也很少有学者使用该方法，本文就该方法主要关键技术点做一综述。 　　1 细胞的选择与培养方式 　　1. 1 细胞的选择 　　由于人牙髓细胞体外培养活性较低、稳定性较差，目前仍不能建立稳定的细胞系，因此在细胞毒性试验中，一般选择与人牙髓组织生理性质相类似的细胞来代替或使用已建标的稳定细胞系，如鼠成牙本质细胞系MDPC - 23[14 - 17]。ISO[3]中也推荐以下为适宜的细胞系: CCL 1 ( NCTC clone - 929) 、CCL163( Balb /3T3 clone A31) 、CCL 171( MRC - 5) 、V -79 379A、CCL 75 ( WI - 38) 、CCL 81 ( Vero) 和CCL10[BHK - 21( C - 13) ]。 　　虽然适宜的细胞系如成纤维细胞系广泛用于口腔材料的生物学评价试验，然而牙髓细胞与其他类型的细胞间存在较大差异，可表现为对材料的敏感程度不同。即便人口腔内的纤维细胞也与牙髓细胞有区别，Arenholt-Bindslev 等对人口腔颊黏膜成纤维细胞和人牙髓成纤维细胞进行了细胞学研究，发现它们在生长方式和酶活性方面均不相同，建议在进行牙科材料的毒理性研究时，应根据细胞的生物特性进行选择。因此，为更好模拟临床替代体内试验，牙本质屏障试验推荐使用牙髓细胞或生理性质相类似的细胞。 　　1. 2 细胞的培养方式 　　传统体外细胞毒性试验使用单层培养的细胞，但是其并不能很好地模拟细胞在人体中的真实生长状况。氧化锌丁香酚和玻璃离子水门汀在传统的细胞毒性试验和利用单层细胞培养的牙本质屏障试验中均表现出很强的细胞毒性，然而在体内使用中却并不损伤牙髓细胞。因此推断，不仅牙本质对材料的细胞毒性结果有影响，细胞的培养方式也是影响试验结果的原因之一。相比单层细胞培养，三维细胞培养可更好地模拟体内正常细胞的生长环境，细胞立体生长且紧密连接在一起，可建立细胞间和细胞与胞外基质间的联系，形成一定的三维结构，且动态的培养基也有助于模拟体内牙髓血液循环。Schmalz 等将三维细胞培养运用于牙本质屏障细胞毒性试验，利用在尼龙网上三维培养的人原代包皮成纤维细胞分别对多种水门汀进行了试验，氧化锌丁香酚和玻璃离子水门汀的毒性大大降低，取得了与体内试验一致的结果。原代细胞虽然比建立了稳定细胞系的细胞更接近体内细胞，但其不易获取，且稳定性差，经长期传代后蛋白质的表达易发生改变，因此可导致试验结果的重复性差。为了结合这两类细胞的优点，可利用病毒转染和3T6 方法来延长原代细胞的生长周期和维持其性质的稳定。Schmalz 等利用SV40 大T 抗原基因转染牛成牙本质细胞进行了一系列牙本质屏障细胞毒性试验，三维培养该细胞后的试验结果与体内试验以及用三维培养人原代成纤维细胞所进行的试验结果一