浅谈牛奶α-乳白蛋白基因实时荧光定量PCR检测方法的建立.docVIP

浅谈牛奶α-乳白蛋白基因实时荧光定量PCR检测方法的建立 　　食物过敏是一个全球关注的公共卫生问题，据统计全世界约有1%～2%成人和5%～8%儿童对某些食物存在过敏反应。联合国粮农组织(FAO，1995)报告指出90%以上的食物过敏反应由以下8大类常见食物诱发：牛奶、鸡蛋、花生、坚果、小麦、大豆、鱼和贝类。牛奶是其中最常见的过敏原之一，牛奶过敏(CMA)是由于摄入乳或含有乳制品的食物而引起的异常免疫反应[5]，在3岁以内儿童中引起广泛的不良反应，其发病率高达2%～7.5%。牛奶蛋白含量丰富，理论而言天然牛奶含有的任何一种蛋白质都有潜在致敏性，但酪蛋白(Casein，CN)、beta;-乳球蛋白(Beta-lactoglobulin，beta;-Lg)及alpha;-乳白蛋白(Alpha-lactalbumin， 　　alpha;-La)被认为是主要的牛奶过敏原。alpha;-乳白蛋白是由LALBA基因编码的一种蛋白质，是乳清蛋白中分子量最小的蛋白质，其分子量约为14　000Da，单体由123个氨基酸残基构成，是牛乳中一种重要的乳清蛋白。alpha;-乳白蛋白耐热性较低，高温可降低其致敏性，但是仍然可诱发严重的过敏反应，被认为是一种重要的牛乳过敏原。 　　目前，防止食物过敏的唯一有效手段是避免食入过敏原，因此对食物过敏原的检测至关重要。至今为止，对食物过敏原的检测方法主要针对致敏性蛋白和间接指示过敏原组分存在的DNA片段。免疫化学方法是目前最常用的过敏原检测方法，可直接检测出致敏性蛋白，但是其存在特异性抗体难获得，容易产生假阳性结果，加工过程酶、温度、压力对蛋白质的破坏影响检测等缺点。DNA比较稳定，食品加工对其影响较小，因而基于DNA的常规PCR和实时荧光定量PCR可以作为蛋白检测的补充方法。关潇等人建立了基于alpha;-乳白蛋白基因的常规PCR定性检测方法，但还未见alpha;-乳白蛋白基因的Taqman探针实时荧光PCR检测方法的相关报道。 　　本研究建立了Taqman探针实时荧光定量PCR方法，用于食品中牛奶主要过敏原alpha;-乳白蛋白基因的检测，与常规PCR方法相比且具有灵敏、快速、简单、安全等优点。与直接检测致敏性蛋白的免疫分析方法相比，可大大降低复杂生物基质中交叉反应导致的假阳性结果，避免对大量抗体的需求，而DNA比蛋白稳定，受食品加工过程影响较小，故可通过对过敏原DNA 片段的检测间接指示食物过敏原组分的存在。因此，本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法可作为目前常用的免疫检测的有效补充，为食物牛奶过敏原的检测提供可靠的保障，可推广到实际食品中的牛奶过敏原检测。 　　1　实验部分 　　1.1　仪器与设备 　　伯乐C1000TM 型PCR仪(美国，Bio-rad(伯乐)公司);SLAN? 全自动实时荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司);DYY-8C琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一制造厂);TU-1900型双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);凝胶成像仪(美国，Bio-rad(伯乐)公司)。 　　1.2　试剂与材料 　　pMD19T-vector，PCR胶回收试剂盒、DNA　Ligation　Kit、质粒DNA 小量纯化试剂盒、2X 热启动PCR 试剂混合物，Takara公司。引物及探针：HPLC纯化，由上海生工生物工程有限公司合成;溴化乙锭(EB)、TBE缓冲液、琼脂糖，上海生工生物工程有限公司;Tris-饱和酚，氯仿、乙醇及异戊醇等其它分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。感受态菌，氨苄青霉素，LB 培养基由上海博仕生物医学服务中心(水源生物)提供。光明鲜牛奶，现代鲜牛奶，特仑苏鲜牛奶，复原乳(A)，麦芽牛乳(B)，高纤燕麦饮料(C)，花生牛乳饮料(D)，果粒奶优(E)，均购自欧尚超市。 　　1.3　DNA的提取 　　提取市售鲜牛奶中的DNA：(1)取50mL鲜牛奶于4个100mL的离心管中，4℃、12　000r/min离心15min，弃上清液，用棉球去除上层乳蛋白和乳脂;(2)加入10mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，溶解沉淀，4℃、12　000r/min离心10min;(3)加入880mu;L　TEN(1mL　lmol/L　Tris+0.2mL　0.5mol/L　EDTA+58g　NaCl定容至100mL)和0.2moI/L　NaOH 溶液120mu;L，悬浮沉淀并震荡混匀30s，95℃条件下水浴8min期间颠倒混匀几次，4℃、12　000r/min离心10min;(4)取上清液至灭菌离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1，剧烈震荡2～3min，4℃、12　000r