研究人肺腺癌HCC827 细胞对细胞因子的杀伤敏感性.docVIP

研究人肺腺癌HCC827 细胞对细胞因子的杀伤敏感性 　　肺癌的发病率逐年增高，目前其发病率和病死率居恶性肿瘤的首位，传统的化学治疗效果已达到一个平台期。近年来，分子靶向药物治疗以其毒副作用小、安全性高等优点成为晚期非小细胞肺癌的主要治疗手段。有研究表明，对于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变的患者，EGFR 酪氨酸激酶抑制剂( tyrosine kinase inhibitor，TKI)较传统化学治疗更能提高患者的反应率并延长其无进展生存期。但大部分患者在平均治疗10 个月后会发生耐药，导致治疗失败。近年来有EGFR 家族药物联合免疫生物疗法治疗恶性肿瘤的相关研究，二者联合应用在提高肿瘤临床缓解率的同时改善了晚期癌症患者的生存质量。刘桂举等研究表明，作为EGFR-TKI 的厄洛替尼能提高野生型EGFR 的肺腺癌A549 细胞表面NKG2D配体的表达，增加细胞因子诱导的杀伤(cytokine-inducedkiller，CIK)细胞对A549 细胞的杀伤能力。本研究选取EGFR 突变型肺腺癌细胞HCC827 为研究对象，观察厄洛替尼及其下游分子磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、信号传导及转录激活因子3(signal transducer and activatorof transcription 3，STAT3)、蛋白激酶C( proteinkinase C，PKC)对HCC827 细胞表面NKG2D 配体表达的影响，探讨厄洛替尼是否提高EGFR 突变型肺腺癌细胞对CIK 细胞杀伤的敏感效应。 　　1 材料与方法 　　1. 1 细胞肺腺癌 　　HCC827 细胞由本实验室常规传代培养。 　　1. 2 主要试剂与仪器 　　Roswell Park Memorial Instiute1640 ( RPMI1640) 培养基购自美国Gibco 公司;CD3 单抗购自美国Pharmingen 公司;乳酸脱氢酶杀伤活性检测试剂盒购自美国Promega 公司;MAPK 抑制剂SB203580、PI3K 抑制剂LY294002、STAT3 抑制剂STAT21、PKC 抑制剂Rottlerin 购自美国Sigma 公司;异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的山羊抗小鼠IgG1 二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司;MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3 单抗及流式细胞仪购自美国Becton，Dickinson and Company 公司;厄洛替尼购自上海罗氏公司，用二甲基亚砜溶解，含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640 培养液稀释至所需浓度。 　　1. 3 CIK 细胞的制备 　　采取健康成年人的外周静脉血50 mL，参照文献方法培养CIK 细胞，每2 ～ 3 d 更换新鲜培养液，培养14 d 后，使用流式细胞仪测定CIK 细胞表型。 　　1. 4 HCC827 细胞培养 　　肺腺癌HCC827 细胞接种于含RPMI1640 细胞培养基( 含体积分数10% 胎牛血清、12 kU·L - 1 庆大霉素) 的培养瓶中，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱孵育，待铺满培养瓶的70% ～ 80%，质量分数0. 25% 胰蛋白酶消化，计数、传代。 　　1. 5 流式细胞仪检测 　　厄洛替尼对HCC827 细胞NKG2D 配体表达的影响HCC827 细胞以5 times;107 L - 1接种于100 mL 培养瓶中，分为空白对照组及厄洛替尼5、10 mu;mol·L - 1组，培养24 h 后，空白对照组不加药物，厄洛替尼5、10 mu;mol·L - 1 组分别加入5、10 mu;mol·L - 1厄洛替尼，继续培养24 h，弃上清液，质量分数0. 25%胰蛋白酶消化，收集HCC827 细胞，__磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS) 洗涤，计数、分管，分别按106 个细胞1 mu;g 加入MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3 单抗，于4 ℃ 反应30 min，PBS 洗涤，再加入FITC 标记的山羊抗小鼠IgG1 二抗，4 ℃继续反应30 min，以离心法用PBS 洗去未结合的单克隆抗体和二抗，上机，同型IgG1 作为阴性对照抗体，用流式细胞仪分析1 times; 104 细胞中的阳性细胞数，计算阳性细胞百分