1.2 基因工程的基本操作选读.ppt

1.将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 （双子叶植物和裸子植物） 农杆菌：在土壤中生活的原核微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染力。 原因：当双子叶植物和裸子植物受到损伤后，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌细胞移向这些细胞，这时，农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 将目的基因导入植物细胞的方法 农杆菌转化法 基因枪法（单子叶植物） 花粉管通道法 （我国独创，转基因抗虫棉由此而得） 2.将目的基因导入动物细胞 显微注射法 用口径为1μm的DNA注射器，将大量的目的基因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。 什么叫显微注射技术？ 显微注射技术 3.将目的基因导入微生物细胞 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: 首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞. 然后将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程. 原核生物特点： 繁殖速度快、容易培养，多为单细胞，遗传物质相对较少。 常用方法：感受态细胞法 检测—— ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 步骤四：目的基因的检测与鉴定 目的基因的检测与鉴定常用的方法是：分子杂交技术 DNA分子杂交原理： DNA分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。其基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。 这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。 因此，当用一段已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。 基因探针： 基因探针即核酸探针，是一段带有检测标记（用放射性同位素或荧光分子标记），且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。 作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：一，应是单链，若为双链，必须先行变性处理；二，应带有容易被检测的标记。 分子杂交技术是基因工程中使用频率较高的一项技术，主要用于检测和鉴定。 杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。 可分为核酸分子之间的杂交和蛋白质分子之间的杂交。 ①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 DNA分子杂交（DNA与DNA分子之间的杂交） 分子杂交（DNA与RNA分子之间的杂交） 抗原—抗体杂交（蛋白质分子之间的杂交） 用标记了放射性同位素的目的DNA片段作探针，检测受体细胞的DNA中有无目的基因 用标记了放射性同位素的目的DNA片段作探针，与受体细胞中的mRNA杂交 个体水平的鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 除了分子检测外 基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、化学方法人工合成 复制原点 + 目的基因 + 启动子 + 终止子 + 标记基因 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、Ca2+处理法 DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原—抗体杂交技术 分子检测外的个体水平鉴定 小结 课本15页 作业：思考与探究：根据基因工程原理，完成第4题实验设计。 1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； 2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？ 农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。