第六章表达谱芯片误差分析和可靠性评估.pptVIP

第六章 表达谱芯片误差分析和可靠性评估 目录 6.1 表达谱芯片实验的重复性评价 6.2 芯片误差来源分析 6.3 减少误差的措施 6.1表达谱芯片实验的重复性评价 一、芯片杂交原理 核酸双链的碱基互补配对原则 芯片杂交条件的选择和优化对结果有很大的影响 二、影响杂交速率和杂交双链稳定性的因素 1. 核酸浓度 杂交的起始速率取决于已固定核酸的有效密度和液相中核酸的有效浓度。 浓度越大，复性速度越快 图6-1 靶基因含量变化对杂交信号强度的影响 图6-2 探针浓度变化对杂交信号强度的影响 2. 探针的类型和长度 同样的序列，含有RNA的双链分子更加稳定, Tm 值也比DNA双链高。杂交稳定性具体排序如下： RNA:RNARNA:DNADNA:DNA 探针长度越短，与靶分子与容易结合，但是形成 双链的稳定性越差。 3. 碱基组成 杂交序列片段的G+C含量高，杂交双链稳定， Tm值也更高。 即使有相同的碱基组成，但是不同的排列方式 也会影响杂交双链的稳定性。如G、C在探针末端 时杂交相对稳定。 4. 杂交液成分 （1）离子强度 在低浓度的离子强度下，杂交速率低，随着离子强度增大，杂交速率迅速提高，但当离子浓度在0.4-1mol/L之间，杂交速率缓慢提高，随后进入平台阶段。 （2）甲酰胺 甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定。 当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35-42 ℃杂交。 每增加1%的甲酰胺浓度，DNA的Tm值 降低0.63℃。 （3）季铵盐 离子极性极强。季铵盐能够选择性地结合A:T碱基对，阻止它们在低温下变性。 （4）杂交加速剂 惰性多聚物能够加快杂交速率， eg：硫酸葡聚糖、聚乙烯乙二醇。 5. 不匹配序列 碱基不匹配会使杂交速率降低，也会降低杂交双链的Tm。 不匹配的碱基的分散程度及聚集位置的不同对杂交双链的稳定性也有影响。 6. 杂交时间 杂交时间实际取决于杂交速率的快慢。 杂交时间短，杂交反应不完全；杂交时间长， 会引起非特异性结合增多。 7. 杂交温度 合适的杂交温度能够很好地平衡杂交速率、特异性和灵敏度。Tm值是确定杂交温度最重要的参数。 三、芯片实验的评估方法 ● 自身比较实验与假阳性、假阴性 ● 相关系数r ● 变异系数CV ● 一致率CR 1. 自身比较实验与假阳性、假阴性 图6-3 一张典型的自身比较散点图 假阳性：在基因表达谱芯片中，基因的表达实际 没有改变，但是却被认为有了改变。 假阴性：在基因表达谱芯片中，基因的表达实际 发生了改变，但是却被认为没有改变。 2. 相关系数r 如果两个变量的变化有如下关系，一个变量 增加，另一个变量也增加（或者减少），就说这 两个变量是相关的。 －1 ≤ r ≤1 r = 0 完全不相关； r = 1 完全正相关， r = －1 完全负相关。 用途：（1）比较两种荧光信号（Cy3，Cy5）的相关性。 （2）比较重复性。 3. 变异系数(Coefficient of variation, CV) 变异系数等于标准差除以均值。 CV可以衡量多组芯片的重复，CV值越小，表明 重复性越好，一般成功的芯片实验平均的CV值在 15%左右。 4. 一致率CR 两次实验的共同差异基因中方向一致的基因数占共同差异基因数的百分比。 对差异基因多的实验有效，但如果差异基因太少，则不适合用一致率来评价重复性。 6.2 芯片误差来源分析 生物学上误差 技术上的误差分析 一、生物学上误差 1. RNA的不稳定性 2. 组织种类的差异 3. 生物个体的差异 4. 细胞周期的不同步 5. 样本来源的差异 二、技术上的误差分析 （一）基因芯片制备过程 1. PCR扩增及纯化过程 2. 点样及点样后处理 （二）样本的检测过程 1. RNA抽提 2. mRNA的标记过程 ● 逆转录酶 ● 逆转录引物 ●