制药工程专业微生物实验讲义.docx

微生物学实验（怀化学院微生物学课程组）微生物学实验室学生要求为了营造一个安全有效、秩序良好的实验室环境，达到“科学、规范、安全、高效”的目的，特对进入微生物学实验室进行实验的学生作如下要求。按已分好的班级组次，按时参加实验，并完成实验项目。进入实验室前，要求穿戴整齐，需穿好实验服，不能穿人字拖类拖鞋进入实验室。上课前要求上交当堂课程的实验预习报告。要求独立或以小组为单位完成实验项目，实验期间保持实验室安静，不能大声喧哗，并及时记录好实验数据。实验完成后及时对实验结果进行分析并完成实验报告。实验完成后需及时清洗实验器皿，清洁和整理实验台，做好卫生，保持实验室干净整洁。授课教师：刘卫今、黎晓英微生物学实验 序号 实验项目名称1实验一、培养基的制备及灭菌2实验二、从土壤中分离和纯化微生物3实验三、细菌革兰氏染色法及芽孢染色法4实验四、油镜的使用和细菌形态的观察5实验五、放线菌、酵母菌和霉菌形态观察6实验六、微生物的计数及大小的测量（以下实验内容仅供参考，具体内容以相应教材为准）实验一 培养基的制备与灭菌一、实验目的1．掌握培养基配制的原理。2．通过对牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、 马铃薯培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。3．解高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。二、实验原理 1．什么是培养基，一般培养基应具备哪些营养要素？2．培养基有哪些类型，为什么培养不同的微生物需要的培养基不同，培养基为什么要调节pH 值，配制好的培养基为什么要立即灭菌？3．高压蒸汽灭菌的原理是什么？三、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖（或蔗糖）、链霉素、1mol/L NaOH、1mol/L H Cl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布和玻璃漏斗等。 四、操作步骤(一 )牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下:牛肉膏3 g，蛋白胨l0 g，NaCl 5 g，琼脂15-20 g, 水1000 mL，pH 7.4～7.6 1. 称量：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2. 加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。 3. 调pH：检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/LHCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4. 过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，此步可省略。5. 分装：披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积内一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/4为宜．灭菌后垂直待凝。6. 加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞，棉塞制作方法则图1－1。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利透气的作用。要使棉塞总长约3／5塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的透气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料盖代替棉塞。7. 包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包—层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。8. 灭菌：将上述培养基于121．3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况没能及时灭菌，则应放人冰箱内暂时保存。9. 摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面长度不超过试管总长的一半。10. 无菌检查。将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24-48h，无菌生长时可以使用，或放置在冰箱或清洁的橱内，备用。 图1-1 棉塞的制作过程(二)高氏1号培养基的配制高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下： 可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3