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细说hi FGF2真核表达载体的构建及其影响 　　成纤维细胞生长因子2( fibroblast growth factor-2，FGF-2) ，也称作碱性成纤维生长因子( basic fibroblastgrowth factor，bFGF) ，广泛参与细胞的生长、分化、迁移、血管生成及肿瘤的发生等过程。FGF-2 基因定位于人类染色体的4q26，全长38kb，含有3 个外显子和2 个内含子。由于其mRNA 有多个翻译起始位点，可以产生18 ku 的低分子量亚型( loFGF2) 和23 ku 的高分子量亚型( hi FGF2) ，低分子量亚型在细胞质和细胞膜中表达，高分子量亚型则主要直接进入细胞核中发挥作用。具有活性的FGF-2 可通过肝素硫酸盐蛋白多糖( heparin sulfateproteoglycans，HSPG) ，与酪氨酸激酶受体性质的成纤维细胞生长因子受体( fibroblast growth factor receptor，FGFR) 结合，激活PKC、Ras /Raf /MEK/ERK、P13K、JAK/STAT 等信号传导通路，参与调节细胞增殖，分化和恶性转化。在心血管系统，有研究结果证明FGF-2 参与了压力负荷和血管紧张素引起的心肌肥厚; AngⅡ与受体结合刺激心肌细胞和心肌成纤维细胞分泌FGF-2，并激活MAPK 信号通路导致心肌肥厚，心脏功能恶化。但是，也有研究表明FGF-2 可以引起细胞染色质浓缩，抑制增殖和引起细胞凋亡。显然，FGF-2 在心血管中的作用尚不完全明了。为了进一步研究hi FGF2 的生物学意义及其机制，本实验构建hi FGF2 的真核表达载体，并在HEK293 细胞中过表达后，观察其对HEK293 细胞凋亡的影响。 　　1 材料与方法 　　1. 1 试剂与仪器 　　重组质粒hi FGF2( 23 ku) -pDsRed1-N1 ( 由德国Hannover 大学Prof. Dr. PeterClaus 馈赠) ，HEK293 细胞株( 中国细胞库) ，LipofectamineTM2000 Reagent ( Invitrogen 公司) ，E. coliTrans1-T1 感受态细胞( 北京全式金公司) ，Nhel 限制性内切酶、EcoRI 限制性内切酶( 美津生物技术公司) ，胶回收试剂盒( 天根生物技术公司) ，质粒小提/中提试剂盒( BIOMIGA 公司) ，高糖DMEM 培养液、胎牛血清( HyClone 公司) ，Annexin V-FITC /PI双染法细胞凋亡检测试剂盒( Mbchem 公司) ，兔抗大鼠FGF-2 单克隆抗体( Epitomics 公司) 。 　　1. 2 实验分组 　　实验分成3 组: 正常组( Control) 、转染空载体( Vector) 组、转染质粒( hi FGF2) 组。 　　1. 3 pDsRed1-N1 真核表达载体的构建 　　质粒FGF2( 23 ku) -pDsRed1-N1 的cDNA 用Nhel 和Eco-RI 双酶切后，琼脂糖凝胶电泳后根据载体DNA 片段大小切胶( 约4 700 bp) ，用胶回收试剂盒回收纯化所切片段，得到少量载体DNA。载体DNA 用感受态细胞Trans1-T1 进行转化，在LB 固体培养基中扩增长出菌落，最后用去内毒素质粒小提试剂盒抽提纯化出质粒DNA，即构建出pDsRed1-N1 真核表达载体。用Nhel 和EcoRI 进行酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳。 　　1. 4 FGF2 在HEK293 细胞中的转染 　　200 ml 的DMEM( 无血清) 中加入4. 0 mu;g DNA，柔和混匀; 200mu;l /孔无血清DMEM 稀释10 mu;l /孔lipofectamin 2000试剂，轻轻混匀，室温放置5 min; 将稀释好的DNA和lipofectamin 2000 试剂轻柔混匀，室温放置20min。将400 mu;l 上述复合物加入到细胞中，细胞在37℃、5% CO2培养箱中孵育24 h 后可通过倒置荧光显微镜观察到荧光，检测转染效率。 　　1. 5 FGF2 在HEK293 细胞中过表达后的检测 　　FGF2 在HEK293 细胞中转染48 h 内提取总蛋白进行Western blot 检测。一抗为兔抗FGF2 单克隆抗体，二抗为羊抗兔多克隆抗体，化学发光液为底物。 　　1. 6 检测过表达hi FGF2 后细胞凋亡 　　用AnnexinV-FITC /PI 双染法细胞凋亡试剂盒检测过表达hiFGF2 后细胞凋亡的情况。pDsRed1-N1-hi FGF2 质粒转染至HE