细说人ENO1( Enolase － α)基因的原核表达和蛋白纯化.docVIP

细说人ENO1( Enolase － α)基因的原核表达和蛋白纯化 　　烯醇化酶- alpha; ( Enolase - alpha;，ENO1) 是烯醇化酶( Enolase，ENO) 的一个亚型。烯醇化酶又称D - 2 - 磷酸- 甘油盐水解酶，是糖酵解所必需的胞内酶，能催化2 - 磷酸甘油盐转化为磷酸烯醇丙酮酸盐，同时也在糖异生过程中催化逆向反应。相关研究表明，多种肿瘤均存在ENO1 的高表达，且与肿瘤的血管生成、侵袭转移及预后有关。为此，本研究通过PCR 的方法从胃癌MKN45 细胞全基因组中获得ENO1 的目的片段，进而构建pET30a( + ) - ENO1 重组质粒并转化入大肠杆菌BL21，表达含组氨酸标签的ENO1 融合蛋白，进而纯化ENO1 融合蛋白，制备其多克隆抗体，并初步鉴定其生物学活性，为肿瘤疫苗研制和肿瘤标志物的快速检测的研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1. 1 质粒载体、菌种和实验动物 　　胃癌MKN45 细胞全基因组、E. clioDH5alpha;、E. clioBL21、克隆载体pET30a ( + ) 均由兰州大学结核病研究中心保存。SPF 级雄性新西兰大白兔购自中国农业科学院兰州兽医研究所。 　　1. 2 主要试剂及仪器 　　T4DNA 连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ均购自Takara 公司; DNA 小剂量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒均购自上海生工公司; PCR 高保真酶购自Fermentas 公司。辣根酶标记山羊抗兔IgG( 北京中杉金桥公司) ; 弗式完全佐剂和弗式不完全佐剂由兰州大学结核病研究中心制备。 　　1. 3 引物设计 　　在GenBank 上查找到人ENO1 的全基因序列，长度为1304bp。用Primer Premier 5. 0 软件进行上下游引物的设计。上游引物为: 5#39; - TAGTAACATATGGCGCGCGAGCTGCGG -3#39;，下游引物: 5#39; - TTCCTCGAGTTAGTGTCGCTCCAGGGCCTT- 3#39;。 　　1. 4 目的基因的获得 　　以人胃癌MKN45 细胞全基因组DNA 为模板，用上下游引物进行PCR 扩增。总反应体系为50mu;l。反应条件: 94℃ 5min，94℃ 45s，55℃ 30s，72℃ 45s，30 个循环; 72℃ 延伸10min。PCR 反应产物经1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 结果。 　　1. 5 重组表达质粒pET30a( + ) - ENO1 的构建 　　用BamH I 和sal I 双酶切胶回收纯化后的pET - 30a( + ) 载体和PCR 产物，用T4DNA 连接酶将pET30a( + ) 质粒与ENO1 PCR 产物进行连接，转化E. clioDH5alpha; 感受态细胞。挑取光滑单菌落接种于含卡那霉素的LB 液体培养基中。菌液PCR 初步筛选出阳性克隆，再抽提重组质粒经BamH I、Sal I 双酶切进一步鉴定后，将筛选出的阳性克隆送至北京六合华大生物技术有限公司测序。测序结果正确的阳性克隆命名为pET30a( + ) - ENO1。 　　1. 6 目的蛋白在E. clioBL21 中的诱导表达 　　将测序结果正确的重组质粒pET30a( + ) - ENO1 转化大肠杆菌BL21 感受态细胞，挑取阳性单克隆接种于含卡那霉素的LB 液体培养基中， 37℃活化过夜，按1∶ 100 比例转接到含卡那霉素的新鲜LB 液体培养基，37℃、180r /min、振荡培养3 小时后，加入0. 5mmol /L IPTG ( Isopropyl beta; - D - 1 -Thiogalactopyranoside) 诱导12 小时，离心收回菌体; 超声破碎后，离心收集上清及沉淀，沉淀用PB 重悬。同法处理BL21空菌，作为阴性对照。加入上样缓冲液，煮沸10 分钟，取20mu;l 进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS - PAGE) 后，用考马斯亮蓝染色，凝胶成像仪进行分析目的蛋白的表达情况。 　　1. 7 表达条件的优化 　　将菌液按1∶ 100 接种于含卡那霉素的LB 液体培养基，37℃振荡培养3 小时后，加入IPTG 至终浓度0. 5mmol /L时， 37℃诱导表达3 小时、6 小时、9 小时、12 小时后收菌，进行SDS - PAGE 分析。 　　1. 8 ENO1 蛋白的纯化及鉴定 　　按上述方法诱导融合蛋白的表达并收集菌体，加入PB重菌体，超声破碎菌体，收集上清。最后用镍离子金属螯合柱