细说促红细胞生成素与甲基强的松龙对星形胶质细胞的作用.docVIP

细说促红细胞生成素与甲基强的松龙对星形胶质细胞的作用 　　目前，甲基强的松龙(MPSS)是临床治疗急性神经损伤相对有效的药物，对损伤早期有一定效果，但不良反应大、后期效果不佳。因此，对于现阶段交通事故及坠落伤导致的高发疾病神经损伤，迫切需要其他药物以得到更好的救治效果。我科研组通过动物大体研究发现，促红细胞生成素(EPO)对神经系统损伤有明显疗效，其他学者同样发现EPO用于神经损伤早期及后期均能显著降低继发性炎性反应及改善预后等。若将两者联合应用，是否会得到更理想的效果，且以原代细胞为载体研究两者联合应用对神经细胞的作用目前尚未见报道。为此，笔者将MPSS与EPO联用对星形胶质细胞(AST)的作用进行了研究，现报道如下。 　　1材料与方法 　　1.1材料器械及仪器： 　　眼科镊，精细刀片，200目滤网，小烧杯，离心管，离心机;37℃恒温摇床，超净工作台，倒置显微镜，匀浆机，高速低温离心机，分光光度仪，聚合酶链式反应(PCR)仪，FR-200型紫外与可见光分析装置。试药与动物：DMEM/F12培养基(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋白酶，多聚赖氨酸(Sigma公司);胶质纤维酸性蛋白(GFAP)荧光抗体(Sigma公司);甲基强的松龙(MPSS，PfizerManufacturingBelgiumNV公司，批号为;促红细胞生成素(EPO，日本麒麟啤酒株式会社高崎医药工厂，进口药品注册证号;磷酸盐缓冲液(PBS，自行配制)。新生SD大鼠(苏州大学动物中心提供，动物合格证号SCXK2008-0005);GFAP引物、beta;-actin引物(生工生物工程lt;上海gt;股份有限公司);PCR试剂(Promega公司)。 　　1.2方法 　　星形胶质细胞原代培养：将新生3d内的SD大鼠静脉血释放、处死，取出大脑(尽量完整)，在预冷的PBS中剥离脑膜，并以PBS冲洗3遍(去血细胞及杂质)，将大脑切碎，吹打均匀，以1000r/min的转速离心10min，取上清液，再次吹打均匀，10min后过滤，按1.5times;107计数接种于培养瓶(需提前1d用0.01%多聚赖氨酸包被)，置培养箱(5%CO2，95%O2，37℃)中培养，3d后换液，8～10d细胞可分裂增殖满瓶壁，放于摇床(200r/min，18h)去除少突胶质细胞和小胶质细胞，换液培养1d后传代，即得到纯度较高的星形胶质细胞，取培养至第3代、第4代的细胞进行试验。分组及处理：将试验用细胞分为8组，分别进行如下处理。正常对照组(A1组)细胞传代后培养2d，弃去培养基，更换新培养基培养;正常细胞+MPSS组(A2组)细胞传代后培养2d，更换培养基，按10mu;mol/L将MPSS加入并于新的培养基培养;正常细胞+EPO组(A3组)细胞传代后培养2d，更换培养基，按10U/L将EPO加入并于新的培养基培养;正常细胞+MPSS+EPO组(A4组)细胞传代后培养2d，更换培养基，将MPSS(10mu;mol/L)与EPO(10U/L)加入并于新的培养基培养;损伤组(B1组)细胞传代后培养2d，以PBS代替培养基培养3h，再换新的培养基培养;损伤细胞+MPSS组(B2组)细胞传代后培养2d，以PBS代替培养基培养3h，将MPSS(10mu;mol/L)加入并于新的培养基培养;损伤细胞+EPO组(B3组)细胞传代后培养2d，以PBS代替培养基培养3h，将EPO(10U/L)加入并于新的培养基培养;损伤细胞+MPSS+EPO组(B4组)细胞传代后培养2d，以PBS代替培养基培养3h，将MPSS(10mu;mol/L)与EPO(10U/L)加入并于新的培养基培养。星形胶质细胞鉴定：以GFAP鉴定，采用免疫荧光染色并鉴定。免疫荧光显微镜观察可见较明显的细胞形态，待星形胶质细胞培养至第3代，细胞爬片3d后用PBS洗3次(5min)后，按荧光染色说明书染色、观察并摄像。MTT法检测细胞活性：将传代至第3代的细胞吹打均匀后，按照1times;106/孔种植于96孔板，待细胞完全贴壁，按照上述分组分别制造试验模型;培养3d后每孔加入MTT20mu;L，继续培养4h后，然后每孔加二甲基亚砜(DMSO)150mu;L，振动器振荡10min;在酶联免疫检测仪上选用490nm波长测定各孔吸光度值，记录结果。PCR法检测GFAP的表达变化：将上述分组(共8组)细胞分别收集1times;106，按PCR仪说明书操作步骤完成。GFAP和beta;-actin引物序列和扩增产物大小见表1。将各组电泳条带通过Smartview-2001生物电泳图象分析软件进行吸光度分析，可得到试验组与对照组各时间点GFA