细说副溶血性弧菌ＶｏｐＴ蛋白的表达及研究.docVIP

细说副溶血性弧菌ＶｏｐＴ蛋白的表达及研究 　　副溶血性弧菌(Vibrio　parahaemolyticus)广泛分布于海水环境和海产品中，流行病学研究显示Vp引起的食源性疾病呈世界性分布，目前已经成为沿海国家和地区面临的重要公共卫生问题之一。研究表明95%以上的环境分离株不具有致病性，尽管耐热性直接溶血素(Thermostable　Direct　Hemolysin，TDH)以及耐热相关溶血毒素(ThermostableRelated　Hemolysin，TRH)被公认的致病性副溶血性弧菌主要的毒力标志物，基于这两个蛋白及其编码基因(tdh 和trh)的生化及分子方法已被用于副溶血性弧菌毒力株的体外检测，但是近年来流行病学调查发现副溶血弧菌的临床分离菌株中存在少数不含有tdh和trh 基因，显示了流行株还存在新的分子特征的菌群。　　VopT是一种具有ADP-核糖基转移酶活性的效应蛋白，它的编码基因(VPA1327)位于副溶血性弧菌染色体Ⅱ的毒力岛上。这种蛋白与绿脓假单胞菌T3SS分泌的双功能细胞毒素ExoT和ExoS的ADPRT结构域分别具有45%和44%的同源性，并且VopT基因敲除能够使副溶血性弧菌毒力株的细胞毒性显著减弱，显示该基因与菌株致病性具有密切关系。另一方面，VPA1327基因片段显示了良好的毒力菌株特异性，是副溶血性弧菌毒力菌株检测的潜在分子靶标，但其编码产物VopT的作用机制、菌群特异性及其在致病菌株快速检测中的应用仍有待深入研究。本研究对副溶血性弧菌大流行株Vop　T的编码基因VPA1327进行表达和多克隆抗体制备，建立了副溶血性弧菌VopT的ELISA检测方法，并验证了Vop　T的毒力菌株特异性，为进一步探讨VopT的作用机制提供了新参考依据。 　　1　材料与方法 　　1.1　材料与试剂 　　副溶血弧菌WX06152(tdh阳性，血清型O3∶K6)为扬州大学食品微生物实验室保藏;E.coliDH5alpha;、E.coli　BL21(DE3)以及表达载体pET-30a(+)为扬州大学江苏省人兽共患病重点实验室保存;限制性内切酶BamHI和Xhol、T4DNA 连接酶、Taq 酶、dNTPs、DNAMarker、PCR产物纯化试剂盒、UNIQ-10柱式DNA凝胶回收试剂盒购自上海生物工程股份有限公司;BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心;酵母浸出粉、胰蛋白胨、IPTG等生化试剂购自北京奥博星生物技术开发有限责任公司，所有化学试剂均为国产分析纯。引物合成及基因测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。 　　1.2　表达载体构建 　　副溶血弧菌基因组DNA的提取参考文献所述方法进行。依据GenBank 中副溶血弧菌VPA1327基因序列和表达质粒pET-30a(+)上的多克隆位点设计引物，上游引物VPA1327-F (P1)为5prime;-GAAGGATCCGTGAAGGTTTGTAGAATACA-3prime;，5prime; 端添加BamHI酶切位点;下游引物VPA1327-R (P2)为5prime;-GAACTCGAGTCACTTAGCTAAATCTAGCG-3prime;，5prime;端添加Xhol酶切位点。25mu;LPCR 扩增体系为：模板(50mu;g/mL)1mu;L;dNTP(10 mmol/mL)0.5mu;L;上游引物(50pmol/mu;L)0.5mu;L;下游引物(50pmol/mu;L)0.5mu;L;10times;Buffer　2.5mu;L;MgCl2(2mmol/L)2mu;L;Taq酶(5U/mu;L)0.5mu;L;ddH2O　17.5mu;L;PCR反应的循环参数为：94℃预变性3min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，35cycles，72℃再延伸10min。　　采用常规分子克隆技术，将VPA1327基因的PCR扩增产物与表达载体pET-30a(+)分别进行BamHI和Xhol双酶切，胶回收目的片段及酶切后的表达载体，采用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，转化感受态细胞E.coli　BL21，于Km+(100mu;g/mL)平板上筛选重组子。提取质粒后，采用PCR、双酶切以及测序鉴定阳性克隆，并用DNAstar软件对测序结果和GenBank中所报道的序列进行比对分析。 　　1.3　诱导表达及表达产物鉴定 　　将鉴定结果为阳性的重组质粒pET-30a(+)-VPA1327转化到E.coli　BL21(DE3)中。挑取上述阳性克隆接种于5mL　LB(Km+)液体培养基中37℃活化过夜，次日以1%接种量接入新鲜的LB(Km+)液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养