细说甲状腺激素基因真核表达质粒的构建.docVIP

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细说甲状腺激素基因真核表达质粒的构建

细说甲状腺激素基因真核表达质粒的构建   0 引言   甲状腺相关眼病( thyroid - associated ophthalmopathy,TAO) 是眼科常见的眼眶疾病之一,目前普遍认为该病为一种自身免疫性疾病,推测在患者的甲状腺和眼眶组织中存在共同的自身抗原,如促甲状腺激素受体( thyrotropinstimulating hormone receptor,TSHR) 、甲状腺过氧化物酶( thyroid peroxidase,TPO) 、甲状腺球蛋白( thyroglobulin,Tg) 以及各种眼外肌抗原,其抗原分子量范围( 23 ~120kD) 很广。目前,所有发现的自身抗原中仍以TSHR 最为重要,对其研究也最多,进一步研究发现TSHR 的胞外区域是引起TAO 的自身抗原,也是与TSH 阻断性抗体( TSH - binding antibody,TSAb) 以及甲状腺结合抑制性免疫球蛋白( thyroid stimulating antibody,TBII) 结合的位点[1 - 6],并开始被用于甲状腺相关眼病动物模型的建立。   1 材料和方法   1. 1 材料   穿梭质粒pHMCMVTSHR289 ( 由Sandra M.Mclachlan,Ph. D Professor of medicine CSMCamp;UCLA 馈赠) ; 真核表达质粒pcDNA3. 1 + ( 华西医学中心眼科实验室提供) ; dNTPs、TaqDNA 聚合酶( 大连宝生物公司,中国) ; PmeI 酶,HindⅢ酶( Fermentas 公司,前苏联立陶宛) ;KpnI 酶,XbalI 酶( 大连宝生物公司,中国) ; DNA 连接酶( 大连宝生物公司,中国) ; Lambda DNA/EcoRI + HindⅢMarker,3 ( Fermentas 公司,前苏联立陶宛) ; 引物及荧光探针( 上海英俊生物技术有限公司合成,中国) ; DH5alpha; 感受态细胞( TIANGEN 公司,中国) ; 质粒小量抽提试剂盒( TIANGEN 公司,中国) ; 普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒( TIANGEN 公司,中国) ; 阳离子脂质体( 获赠于四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室) 。   1. 2 方法   1. 2. 1 质粒DNA 的抽提与鉴定真核质粒pcDNA3. 1 +转化大肠杆菌感受态细胞DH5alpha;,用质粒抽提试剂盒抽提真核质粒pcDNA3. 1 + ,采用紫外分光光度计检测抽提得到的质粒pcDNA3. 1 + DNA 的浓度与纯度。用同样的方法得到穿梭质粒PHMCMVTSHR289,两种质粒均送至公司测序,序列正确,说明转化成功。   1. 2. 2 构建重组质粒pcDNA3. 1 + /TSHR289 与鉴定PCR 扩增穿梭质粒PHMCMVTSHR289 目的基因,扩增产物与真核质粒pcDNA3. 1 + 采用KpnI 和XbalI 双酶切后,产物纯化回收用T4DNA 连接酶完成连接反应,得到pcDNA3. 1 + /TSHR289 重组质粒,用琼脂糖凝胶电泳、HindⅢ酶切以及正反向测序的方法进行鉴定。   1. 2. 3 DNA/阳离子脂质体复合物的制备精密称取一定量DOTAP 和Chol ( mol /mol = 1∶ 1) 于100mL 旋蒸瓶中,加入20mL 氯仿溶解,置于旋转蒸发仪上,40℃ 水浴下旋转蒸发1h。取下旋蒸瓶,放入真空干燥器中,真空干燥12h。往旋蒸瓶中加入5% 葡萄糖溶液18mL,并将其置于旋转蒸发仪上,在55℃水浴温度下,关闭水泵,旋转1h,得到乳白色黏稠状液体。取下旋蒸瓶,向瓶中插入超声探头,在55℃水浴下超声10min,即得DOTAP /Chol 阳离子脂质体( 5mg /mL ) 。pcDNA3. 1 + /TSHR289 重组质粒与DOTAP /Chol 阳离子脂质体按照质量体积比1∶ 3 混合。   2 结果   2. 1 穿梭质粒PHMCMVTSHR289PCR 产物和真核质粒pcDNA3. 1 + KpnI 和XbalI 双酶切产物鉴定两种质粒双酶切的产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测显示,穿梭质粒PHMCMVTSHR289PCR 产物双酶切后的条带大小为867bp,真核质粒pcDNA3. 1 + 双酶切后条带大小为4 459bp。   2. 2 重组质粒pcDNA3. 1 + /TSHR289 HindⅢ酶切鉴定重组质粒pcDNA3. 1 + /TSHR289 用HindⅢ酶切后产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测显示,出现512bp 小条带。

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