生化实验01-蛋白质含量的测定研究报告.ppt

实验室规章制度 实验室安全（人身安全、财产安全、环境安全） 规范操作（2人/组，每人必须动手做实验) 实验室卫生（仪器、试剂、器皿、桌面，值日生） 实验报告（完整、规范，原始数据，结果分析讨论） 不能迟到早退，不能在实验室吃东西 * * 实验01 植物组织中蛋白质含量的测定（Folin—酚试剂法） 了解、掌握可溶性蛋白质测定的常用方法。 一、实验目的 * 二、实验原理 Folin-酚试剂法（Lowry法）结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应。 第一步反应：在碱性条件下，蛋白质的肽键与铜结合生成紫红色的蛋白质-铜络合物(双缩脲反应)； 第二步反应：此络合物及蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸等使磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物质，其颜色深浅与蛋白质含量成正相关，在650nm下比色测定即可进行定量测定。 * 1. Folin—酚试剂法的特点 （1）灵敏度高：比双缩脲法高100倍。 （2）适用范围：微量蛋白质（0.02～0.50mg/mL）测定. 2. 干扰因素： 酚类、柠檬酸和巯基类化合物等还原性物质会导致测定结果偏高。 * 三、材料、设备与试剂 （一）实验材料 绿豆芽下胚轴 （二）设备 天平；分光光度计；移液器等。 （三）试剂 1. Folin试剂甲-- 试剂A：试剂B = 50：1(V/V) 现配现用 2. Folin试剂乙（已配制） 3. 标准蛋白质溶液： 250 μg/mL。 * 四、实验步骤（一）标准曲线的制作 管号 1 2 3 4 5 样品溶液 标准蛋白溶液 (mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0mL 蒸馏水 (mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 试剂甲 5mL，混匀后室温下放置5~10min 试剂乙 0.5mL（逐一加入并立即混匀），20~30min后，测定A650 * 标准曲线绘制： 以每管标准蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度（A650）为纵坐标，在坐标纸上绘制出标准曲线。 比色测定： 1号管为空白，在650nm波长下用10mm光程的比色皿测定各管的吸光度。 A650 蛋白质(μg) 0 * 0.2～0.5g绿豆芽下胚轴于研钵中 —→加1~2mL水—→研磨、匀浆后定容至25mL —→室温下放置10~20min（间歇振荡） —→过滤后得到待测样品溶液。 分别取样品待测液1.0mL于3支试管中（3次重复）进行显色、测定（参考制作标准曲线的步骤）。 （二）样品中蛋白质的提取及测定 重现（复）性、严谨性、透明性和独立验证是科学方法的基石 生物重复（?biological repeats） 实验重复或技术重复（technical repeats） * 对照组 处理组 R1 R2 R3 T1 T2 T3 R1 -1 R1 -2 R1-3 R2-1 R2 -2 R2-3 R3 -1 R3-2 R3-3 T1 -1 T1 -2 T1-3 T2 -1 T2 -2 T2-3 T3 -1 T3 -2 T3-3 3个生物重复 3个技术重复 * 五、原始数据 A650的记录 管号 1 2 3 4 5 测定-1 测定-2 测定-3 标准蛋白含量 (μg) 0 50 100 150 200 A650 W= VT= VS= N= 六、结果计算 标准曲线的绘制： 1、坐标纸绘制 2、在excel中绘制并求  出回归方程 * 蛋白质含量（ μg ） A650 50 100 150 200 0.3 0.2 0.1 * X：根据样品的吸光值查得的蛋白质含量（ μg ）； X1= , X2= ，X3= ，X平均= * 样品中蛋白质的含量（mg/g）＝ X：根据样品的吸光值查得的蛋白质量（μg）； VT：提取液总体积（mL）； Vs：测定时取用的样品体积（mL）； W：样品鲜质量（g）； N：样品稀释倍数） * 八、分析与讨论 七、注意事项 1. 试剂乙在碱性环境中不稳定。2. 酚类、柠檬酸、还原性糖类等物质有干扰。