感受态细胞的制备和转化.ppt

一 实验原理 转化作用是在一定条件下，一种特定的DNA分子（供体或称转化因子）转入到一定的细菌体内（受体菌），使其发生遗传形状改变的过程。 在正常生长条件下，少数细菌可发生转化作用，但大多数细菌并不发生转化，只有在一定条件作用下（如用Ca++处理细菌细胞或电刺激），细菌呈现感受状态后，外源DNA才能转化进入受菌体内。因此，若想将外源DNA分子转化进入一定的受菌体内，通常需将受体菌先制备成易感受状态。 一 实验原理 感受态通常指的是细菌具备吸收转化因子的一种生理状态。 一般说来，细菌细胞在对数生长的早中期，经处理后，有一定的转化能力，但在它们进入静止生长期以后，就逐渐丧失。因此进行细菌细胞转化时，掌握合适的细菌培养时机是很重要的。 本实验所用的供体DNA分子为一个重组质粒，含有编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（GST）的基因。因此可在受体菌体内将表达出GST。实验中所用的受体菌为大肠杆菌BL21（DE3）选择此菌株是因为可用乳糖替代IPTG作为目的基因表达的诱导剂，使实验的进行更为经济。 LB液体培养基： 1000ml含蛋白 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g， 溶于950ml双蒸水中， 用NaOH调pH至7.0，然后定容为1000ml。15磅20分钟高压灭菌。需加抗菌素时，冷却至50℃以下，加入相应浓度的抗菌素。 LB固体培养基：向LB液体培养基中加入2.0%的琼脂粉，15磅20分钟高压灭菌，然后加入适量抗菌素，向每个 平板中倒入15-20mlLB固体培养基，凝固后倒置，4℃保存。 转化试剂：CaCl2溶液（lM）：取54g CaCl2·6H2O溶于20ml无菌水中，15磅20分钟灭菌后，分装成小份于4℃保存。 菌株与质粒：大肠杆菌BL21（DE3）[hsdSgal（λcits857indlsam7ni5lacuv5-T7 genel）]。 质粒pGEX-6p。 1大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的制备 将一BL21（DE3）单菌落种于20mlLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取5ml上述菌液转种于50ml培养液中，37 振荡培养约1小时，至0.D600值为0.4-0.5左右，停止培养，菌悬液于冰上冷却10分钟后，转至40ml灭菌离心管中，在4℃，4000rpm离心10分钟，弃上清，菌体悬于10ml预冷的无菌的0.1M CaCl2溶液中，冰浴15分钟，然后在4℃4000rpm离心10分钟。弃上清，菌体重新悬于2ml预冷的无菌的0.1M CaCl2溶液中，置冰上3-4小时后即制得感受态细胞。 2 重组质粒pGEX-6p DNA的转化 取上述感受态细胞200μ1，加重组质粒DNA2μ 1（约10ngDNA），混匀后，冰上作用30分钟，然后转到42℃水浴 进行热休克90秒，快速转移样品到冰浴，预冷1-2分钟，加0.8mlLB液体培养基，37℃培养45分钟后取原液各0.2ml涂布Amp平板，同时将0.2ml感受态细胞涂布于Amp平板作为对照。倒置平板，37℃恒温培养箱中培养12-16小时，观察对照转化的平板，观察转化子出现的数目，计算转化效率。所得的到的单菌落即为菌株BL21（DE3）pGEX-6p。 转化效率计算公式如下： 转化子总数 转化频率= DNA加入量 =转化子/μg DNA 转化子总数=转化菌落数*稀释倍数*转化反应液体积 1 试总结出实验成功的关键步骤。 2 用乳糖作为BL21（DE3）菌株目的的基因表达的诱导剂的作用机制是什么？ 3 在用氨苄青霉素作为抗菌素筛选转化子是，一般37℃培养时间不超过20小时，为什么？ 4 氯化钙转化与电转化相比有哪些优点和缺点。 * * 实验 三 感受态细胞的制备和转化 二 实验试剂 二 实验试剂 三 操作步骤 三 操作步骤 四 实验结果 五 思考题