第21章毛细管电泳与电色谱.ppt

本章要点 电泳与电渗 区带毛细管电泳 胶束电动色谱 毛细管电色谱 猪基因组DNA1%琼脂凝胶电泳图 21-1 高效毛细管电泳 概述 高效毛细管电泳的理论 毛细管区带电泳 胶束电动色谱 毛细管凝胶电泳 一、概述（包括电泳仪） 高效毛细管电泳的发展 高效毛细管电泳的特点 高效毛细管电泳仪 （一）高效毛细管电泳的发展 在外加电场的影响下，带电的胶体离子或离子在分散介质中作定向移动的现象称为电泳。(1808年) 1907年有人利用电泳现象建立了分离分析技术（白喉毒素和抗体） 1948年Tiselius因建立蛋白质的电泳分离技术，获得诺贝尔奖 （1937年的工作） 毛细管电泳的重要发展历程 毛细管电泳的重要发展历程 Jorgensen and Lucacs (CZE) Clin. Chem. 27 (1981)1551 Anal. Chem. 53(1981) 1298 J. Chromatogr. 218(1981)209 Science 222(1983)266 Terabe (MEKC) Anal. Chem. 56 (1984)111 高效毛细管电泳 高效毛细管电泳是指溶质以电场为推动力，在毛细管中按淌度差别而实现的高效、快速分离的新型电泳技术。 HPCE (High Performance Capillary Electrophoresis) (四)高效毛细管电泳的特点 与传统电泳技术及现代色谱技术相比： 仪器简单、操作方便、易自动化 分离效率高(105 - 107 块/m) 、分析速度快 操作模式多 实验成本低，消耗少 重现较差，分析结果误差大 （二）毛细管电泳仪 毛细管 高压直流电源 检测器 在线检测示意图 在线检测示意图 进样方法 电堆积富集 电堆积富集是使样品离子在柱上进样过程中得到富集的一种技术。 要求：样品溶液的离子强度小于背景电解质溶液。 原理：电场强度差异 例 （三）毛细管电泳的几种分离模式 毛细管区带电泳（CZE, capillary zone electrophoresis) 胶束电动色谱（MEKC, micelle electrokinetic chromatography) 毛细管凝胶电泳（GCE, gel capillary electrophoresis) 毛细管等电聚焦（CIEF, capillary isoelectric focusing) 毛细管等速电泳（CITP, capillary isotachophoresis) 毛细管电色谱 (CEC, capillary electrochromatography) 二、高效毛细管电泳的理论 电泳(electrophoresis) 电渗(electroosmosis) 分离柱效与分离度（分辨率） 引起峰展宽的因素 （一）电泳与电渗 电泳：溶液中带电粒子（离子）在电场中定向移动现象 （一）电泳与电渗 电渗：指在电场作用下，毛细管中或固相多孔物质内， 液体沿固体表面移动的现象。 石英毛细管内壁示意图 Diagram of Electroendosmotic flow (EOF) 电渗流流型 电渗流速 带电粒子（离子）在毛细管中的迁移速度 * 一般情况下，电渗流速度比电泳速度大5-7倍 迁移时间 迁移时间 毛细管电泳分离 (二)分离柱效与分离度 柱效率 （Efficiency) 选择性 (Selectivity) 分离度 (Resolution) (1)柱效 理论塔板数（Giddings的定义） 假设分子扩散为峰扩展的唯一因素，由Einstein扩散定律 D为扩散系数；t 为迁移时间 (1)柱效 毛细管电泳的柱效方程： 提高分离电压 V，有利于提高理论塔板数 l/L值越大，理论塔板数越大 当电泳与电渗同向时，电泳迁移率越大，理论塔板数越大 (2)选择性 （3）分离度 （三）引起峰展宽的因素 实际上，N理论N实测 （因理论值只考虑分子扩散） 其它因素： 由进样引起的峰加宽。 焦耳热和温度梯度引起的峰加宽。 由溶质与管壁间的相互作用引起的峰加宽。 电分散: 样品与缓冲溶液间电场强度、淌度差异。 由其它因素引起的峰加宽， 如压差引起的抛物线流。 三、毛细管区带电泳 外加电压 毛细管电泳柱 缓冲溶液 缓冲溶液添加剂 应用例 （1）外加电压 柱效 N （N - V） 分离度 Rs （Rs -- V1/2) 分析速度 ( t -- 1/V) 焦耳热 (Q -- E2) 不同浓度缓冲溶液下N-V关