第04章临床酶学检验技术.pptVIP

生物体内的酶（enzyme）是对其特异底物起高效催化作用的蛋白质和核糖核酸，前者是是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。 酶的特性 （一）高效催化性 （二）高度特异性 （三）可调节性 （四）不稳定性 绝对特异性(absolute specificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物 。 相对特异性(relative specificity)：作用于一类化合物或一种化学键。 立体结构特异性(stereo specificity)：作用于立体异构体中的一种。 表示为： 底物：Subestrate：S 产物：Product：P 酶 ：Enzyme：E （一）米氏方程 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程（Michaelis-Menten equation）。 （二）动力学参数 1.初速度(initial velocity)：在反应最初阶段底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度，用v0来表示 2.最大反应速度(maximum velocity)：当酶的结合位点与底物结合饱和时的反应速度，通常用V或Vmax来表示 3.米氏常数（Michaelis constant，Km）：酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位同底物浓度 （三）Km在临床上的应用 （1）反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。 （2）计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的百分率。当底物浓度为10～20Km时，反应速度可达到最大反应速度的90﹪～95﹪。 （3）根据Km值选择酶的最适底物。 （4）确定工具酶用量。 （5）确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依据。 （四）影响酶促反应的因素1.底物浓度对酶促反应的影响 （1）当[S]Km时，反应速率与底物浓度[S]成正比，呈一级反应。 V＝Vmax[S]/Km＝K[S] ——用工具酶来测定各种代谢物浓度的方法学基础。 （2）当 [S]Km时，反应速率与底物浓度[S]无关，V＝Vmax＝K [E]，称为零级反应，反应速率与酶浓度[E]成正比。 酶学测定时一般底物浓度可选择为Km的10～20倍。 底物浓度与Km比值相当的最大反应百分比 2.温度的控制 最适温度：不同酶类、反应条件 （1）Q10值：温度增加10℃，化学速度的变化率。酶的Q10值：1.5 ~ 2.5。 （2）使用37℃，是从实际工作方便来考虑。因为温度升高，反应速度快，灵敏度高。同时延滞时间和测定时间都可能缩短。从而有利于提高工作效率。但在37℃时，不可避免地一些酶可能失活。 （3）曾推荐25℃为酶测定温度，其优点为接近室温，反应体系温度很容易平衡到此温度。但温度低，反应太慢。 （4） IFCC推荐的30℃，兼顾了上述二温度的优点，即保证了一定的反应速度，又无酶失活之扰。 常见酶温度转化系数 3.辅因子、活化剂的种类和浓度 辅因子（cofactors）:一种酶的活性所需要的一种非蛋白质成分。 （1）辅酶（Coenzyme）：NAD、NADP、ATP等，与酶蛋白结合很松弛，用透析和其它方法很易将它们与酶分开。在作用方式上和底物类似，在方法学上，将它们按底物处理。 （2）辅基 ： 是酶蛋白不可分割部分，转氨酶需要磷酸吡哆醛为其辅基。 显著特点之一是与酶结合需要一定时间，因此在酶测定时，先加入足量辅基，作用一定时间如10分钟后，再加入底物开始酶反应。 （3）离子 很多酶需要特定离子帮助才能使其反应达到最大速度。最常见的是二价金属离子如Mg2+、Zn2+等。要选择合适的浓度。 （4）其它 如巯基化合物可稳定酶的双硫键。 4. 抑制剂 最常见的抑制剂：产物的抑制、底物的抑制，重金属及体液中的药物等造成的抑制。 抑制类型：可逆抑制、不可逆抑制。 去除抑制采取的措施：选用高纯度的原料、高纯净水、器材干净，在反应液中加入金属螯合剂，甚至可以引入一个副反应来去除产物的抑制作用。 5.缓冲液的种类、离子强度和pH 根据对酶活性的影响不同可将缓冲溶液分为活性、抑制、惰性三类。 各种体液样品也是缓冲液，应严格掌握测定样品与底物的用量比例，样品在总体积中所占的比例应不超过10%。 四、酶促反应进程 1.延滞期 酶促反应开始至达到最大反应速度所需要的时间。 2.线性期 酶促反应速度保持恒定的时期，不受底物浓度的影响。 3.非线性期 随着反应时间的延长，底物消耗越来