第三章_基因克隆的酶学基础.ppt

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第三章_基因克隆的酶学基础

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 反应体系 管1 管2 ddH2O 6 μL 14 μL 10×buffer 2 μL 2 模板 质粒 10 μL λDNA 2 μL HindⅢ 2 μL 2 μL 总共 20 μL 20 μL 1 2 3 4 5 6 7 质粒1 质粒1 λDNA Marker 质粒2 质粒2 λDNA —— —— —— —— HindⅢ HindⅢ HindⅢ HindⅢ 8 μL 2 0 μL 20 μL 5 μL 8 μL 20 μL 20 μL 点样情况: 注意:酶切产物全部上样 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 第六节 单链核酸内切酶 1、来源 真菌Aspergillus oryzae(稻谷曲霉) 2、特点 pH4.0-4.3,低水平Zn2+ (1)可以降解单链DNA和RNA 一、S1核酸酶 (2)作用于双链分子的单链区,并从此切割核酸分子 3、RNA分子定位 3’ 5’ DNA RNA AAAAA 400 1400 A S1核酸酶 碱变性,电泳检测大小 Endo RX B C 3’ 5’ DNA RNA 1000bp S1核酸酶 3’ DNA RNA 3’ 5’ DNA RNA AAAAA 二、Bal-31核酸酶 1、来源 埃氏交替单胞菌中分离而来 2、特点 单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性 需要Ca2+和Mg2+,EGTA可终止反应 (1)双链环型DNA:单链特异的核酸内切酶活性通过单链切口或瞬时单链区的降解作用将超螺旋结构降解为线性DNA (2)线性双链DNA:双链特异的核酸外切酶会从两端去除核苷酸,能够有效的控制降解速度。 Ca2+ (3)单链DNA或者RNA(单链特异的核酸内切酶活性) 5’ 3’ Ca2+ dNMP或rNMP (4)内切酶活性,即从内部切割DNA的单链区 ,3’外切酶活性大约为它的单链特异性内切酶活性的20倍 Ca2+ 3、用途 ①用于不同长度的删除突变克隆实验及基因结构、机能分析——控制消化法 A EcoRⅠ EcoRⅠ酶切 A Bal 31降解 加衔接物环化 形成缺失的质粒分子 ②绘制DNA限性内切图谱 Bal 31降解DNA绝对依赖于钙离子的存在。因此可以在反应的不同阶段加入螯合剂EGTA而使反应终止。限制性酶切,考察酶切谱带的消失顺序,判断酶切位点的位置 由于Bal 31从末端降解DNA的作用相对比较均匀,因此Bal 31可用于确定DNA小片段的限制酶切图 。 练习:已知一个原核生物基因的两端序列,请设计实验在大肠杆菌中大量扩增这个基因。 5’端为 GCTCCATGACCCAGGCA 3’端为 CGATCTTTTGAGTCCATG 5’ GCTCCATGACCCAGGCA————GATCTTTTGAGTCCATG 3’ PCR(Taq) 上游引物: 5’ GCTCCATGACCCAGGCA 3’ 下游引物:3’ CTAGAAAACTCAGGTAC 5’ A A T vector T4 ligase 5’ GCTCCATGACCCAGGCA————GATCTTTTGAGTCCATG 3’ 上游引物: 5’ GGAATTCGCTCCATGACCCAGGCA 3’ 下游引物:3’ CTAGAAAACTCAGGTACAGATCTGC 5’ EcoRI BglII PCR扩增 GGAATTC CCTTAAG TCTAGACG AGATC

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