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实验五 酶联免疫吸附实验 免疫酶技术 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体（或抗原）联结，与相应的抗原（或抗体）作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。 目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA）。 间接法比直接法灵敏 由于结合在抗原—抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3～5个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3—5分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。 一 、ELISA法间接法检测血清中HBsAb 【实验目的】 　　1．熟悉ELISA的原理。 　　2．了解免疫标记技术的原理。 【实验原理】 　　采用纯化HBsAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP。 当标本中存在HBsAb时，就会形成HBsAg-HBsAb-HBsAg-HRP复合物，加入TMB(四甲基联苯胺 )底物产生显色反应，反之就无显色反应。 加入酶复合物， (HBsAg-HRP),酶复合物与表面抗体结合 加入酶的底物，酶与底物反应，显色 二、ELISA间接法检测血清中HBsAg 原理同检测抗体,但小孔底部包被的为HBsAb 酶复合物为:HBsAb-HRP 当标本中存在HBsAg时，就会形成HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP复合物，加入TMB(四甲基联苯胺 )底物产生显色反应，反之就无显色反应。 【实验材料】 　　1．乙肝病毒HBsAg（或HBsAb）酶联免疫诊断试剂盒。 　　预包被微孔条（用纯化的单抗-HBs或纯化HBsAg包被） 　　酶结合物（多克隆抗-HBs-HRP或HBsAg-HRP ） 　　阳性对照 　　阴性对照 　　洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释25倍) 　　显色剂A、B（一般为四甲基联苯胺和H2O2 ） 　　终止液（2 mol/L H2SO4）。 　　2．微量加样器，吸水纸等。 【注意事项】 　　1．试剂盒应于4℃存放，在有效期内使用。 　　2．微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。 　　3．滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。 　　4．洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。 　　5．待测标本不可用NaN3防腐。所有样品都应按传染源处理。 观看实验录像 临床ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因?（非试剂盒本身的原因）? 1．弱阳性样本检测不出??温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题? 2．测定的重复性差??（相同样本两次测定结果不一致）?这是典型的由测定操作引起的问题，包括?（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；?（2）加样过快，孔间发生污染；?（3）加错样本；?（4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；?（5）不同批号试剂盒中组分混用；? （6）温育时间、洗板、显色时间不一致；?（7）孔内污染杂物；?（8）酶标仪滤光片不正确；?（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。? 3．白板?（阳性对照不显色）??（1）漏加酶结合物；?（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。?（3）漏加显色剂A或B；?（4）终止剂当显色剂使用。? 4．全部板孔均有显色??（1）洗板不干净；? （2）显色液变质；? （3）加底物的吸光受酶污染；? （4）洗板液受酶等污染。 * ELISA简介 1971年瑞典学者 Engvall 和Perlmann，荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（ELISA） ELISA基本的实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色 ELISA检测抗原 Ag + Ab* Ag-Ab* ELISA检测抗体 Ab + Ag* Ab-Ag* ELISA检测抗体(间接法) Ag + Ab1 Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2* Ag-Ab1-Ab