聚乙二醇化重组人生长激素质控难点探讨.doc

聚乙二醇化重组人生长激素质控难点探讨 李晶 中检院生化及基因工程药物室 正文 重组人生长激素(Recombinant human growth hormone, rhGH)是由大肠杆菌或酵母菌表达的一种重要的非糖基化蛋白质激素，由191个氨基酸残基组成，相对分子量为22,125，等电点为5.2。临床上，主要用于治疗因内源性hGH缺乏而导致的儿童侏儒症、成人生长激素缺乏症等其体内半衰期仅为0.5~2hr左右，故需要每天、长期注射才能发挥疗效，治疗周期往往为一年以上[]。聚乙二醇（Polyethylene glycols, PEG）是一种毒性极低的线性大分子聚合物，具有水溶性和免疫惰性。蛋白类药物经PEG修饰后，可延长半衰期，增加稳定性，同时降低免疫原性和抗原性[3]。。目前国内已有家企业申报了3种PEG-rhGH注射液，其中一家企业已取得了临床批件。 PEG-rhGH是在已收载于中国药典2010年版的比较成熟的重组人生长激素基础上进行研发的，但是，其质量标准中各项目及限度的制定不应简单地照搬rhGH的标准，还应结合其自身独特的理化结构性质及生物学活性，着重考虑PEG有关的质控项目。 1996年，美国Genentech公司的Clark等人利用分子量为5kDa的聚乙二醇（PEG），对重组人生长激素进行了长效改构研究[5]。研究结果表明，偶联后的重组人生长激素随着PEG偶联数目的增多，其体内半衰期也相应延长，但其与受体结合的活性及体内刺激大鼠胫骨增殖的活性却随着偶联数目的增加而急剧下降。同时，rhGH上可发生PEG修饰的10个位点中，有4个位点处于rhGH与受体的结合部位，直接影响着rhGH的活性。因此，每个rhGH分子究竟结合了几个PEG？这些PEG究竟结合在rhGH的哪些位点上？与这两个问题密切相关的两个指标——PEG对rhGH的平均修饰率与PEG在rhGH上的修饰位点就成为该类产品的重要质控指标与质控难点。 目前尚无国外产品的质量标准可供参考，国内企业与此相关的质控技术还有待于进一步完善。本文即从这两个质控关键技术进行讨论，并对质量标准制定中一些需重点关注之处进行说明。 1 PEG的平均修饰率 目前，的检测方法主要有：三硝基苯磺酸（TNBS）法、荧光胺法、、等其中，三硝基苯磺酸（TNBS）法荧光胺法PEG化蛋白进行反应条件考察，并建立相应的rhGH工作对照品。同时，由于荧光胺在水溶液中分解极快，为保证操作的便捷与准确性，应将荧光胺的丙酮溶液直接加入到反应液中，并迅速混匀，而不宜在接触到蛋白质溶液之前用水溶液稀释荧光胺。 上述两种方法进行准确测定的前提条件是，无论修饰前后，rhGH都必须处于充分舒展的状态，所有的结合位点都能充分暴露。但是，由于PEG枝杈型的空间位阻效应，同时方法易受常规变性剂的干扰，测定结果不可盲目追求理论平均修饰率10%，应根据多批次测定结果，合理制定限度范围。 1.4液相-示差/蒸发光检测器联用法 PEG分子在280nm下并无特征紫外吸收，而活化后的PEG分子，由于活性基团的引入，可能存在214nm下的紫外吸收。因此，为了检出以各种形式存在的PEG，应采用通用型检测器，并结合凝胶或反相等高效液相色谱对修饰前后的rhGH及游离的PEG进行分离。由于示差检测器的灵敏度较低，同时只能使用恒梯度流动相，因此，不适于检出痕量的游离PEG。而蒸发光检测器在上述方面有较大优势。首先通过优化色谱条件，将PEG-rhGH、rhGH与游离PEG有效分离后，再将PEG从修饰后的rhGH上水解下来；通过计算水解后PEG减去游离PEG的量，再除以PEG的分子量得到偶联到rhGH上的PEG的摩尔数，进而通过紫外检测器求得rhGH的摩尔数，两者之比再除以10（每分子rhGH的理论修饰位点），即可求得较为准确的平均修饰率。该方法不仅可适用于单位点或多位点PEG-rhGH的平均修饰率测定，而且可有效鉴别不同生产厂家使用的不同种类的PEG，同时可测定原液中的游离PEG含量，实现一个方法进行三项重要指标的质量控制。但是，目前该类方法可供参考的国内外文献极少，方法的建立需要投入较大的工作量。 2 PEG的修饰位点 rhGH上可发生PEG修饰的位点有10个，即使均为单位点修饰，理论上也可能存在10种位点异构体。同时，PEG分子本身是由一系列具有一定分子量分布的物质组成的混合物，因此，每一种位点异构体也就成为了较复杂的混合物。这就给PEG修饰位点的测定带来了巨大的难度。目前可采用2种方法进行PEG修饰位点的测定：液相肽图法与离子交换分离位点异构体法。这两种方法都需要结合质谱，对rhGH液相肽图中的色谱峰准确定性。在此基础上，前者推断修饰位点，后者可较为准确地测得修饰位点。 2.1 液相肽图法 首先需建立适宜的rhGH与PEG-rhGH的酶切方法。由于P