南京农大动物生物化学17幻灯片.pptVIP

第17章 核酸技术Technology of Nucleic Acid 对遗传分子核酸的结构与功能的阐明，用于研究核酸的工具酶的开发，由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术，使我们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因，去改变生命有机体的遗传性状，甚至制造出新的物种，以服务于人类。重组DNA技术使人类千百年的梦想变为了现实。 50年来，核酸酶学的进步为DNA的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的核酸酶有： DNA聚合酶（DNA polymerase ） klenow 片段， Taq 酶 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） 逆转录酶（Reverse transcriptase） S1核酸酶（ S1 nuclease） 连接酶（Ligase） 拓扑异构酶（Topoisomerase）等 限制性核酸内切酶—— 一把神奇的“手术刀” 具有内切和甲基化两种功能 能够识别外源的核酸并将它切除 有特异的识别位点，通常为4-8对碱基的旋转对称结构 在其切口处留下黏性末端（sticky end）——具有互补序列 的单股链，或者平头末端（blunt end） 有3种类型，II型为主 例如： EcoRI 利用一个标记的（如用同位素标记），特异的，单股DNA或RNA片段——探针（probe）， 可以： 研究DNA之间的亲缘关系； 发现基因的缺失或突变； 测定某种遗传信息的量； 鉴定某种基因 基因治疗等 分子杂交是一系列基因鉴定方法的基础 印迹技术（ Blotting） Southern blot——用探针鉴定DNA Northern blot——用探针鉴定RNA 原位杂交（Hybridization in situ） 指纹分析（Finger printing） 基因芯片（ DNA microarray） 在人类基因组项目基本完成之后，人类蛋白质组项目将要展开，旨在对人类基因组表达的全部蛋白质进行全面的、高通量的、精细的分析，这是后基因组时代的新的研究领域，对于人类认识自己，控制疾病的意义将难以估量。 * * 本章主要内容： ??? DNA重组技术 ?? 基因鉴定 核酸技术的应用 一个梦想已成真 生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“硕鼠” 1.DNA重组技术 DNA重组技术是利用多种限制性内切酶和DNA连接酶等工具酶，以DNA为操作对象，在细胞外将一种外源DNA（来自原核或真核生物）和载体DNA重新组合连接（重组），形成重组DNA，然后将重组DNA转入宿主细胞（如大肠杆菌等），使外源基因DNA在宿主细胞中随宿主细胞的繁殖而增殖，并在宿主细胞中得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。“基因工程”（gene engineering）或“分子克隆”（molecular cloning）。 基因重组技术的 两个基本目的 1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等 2.利用基因的表达产物 疫苗、药物、 组织激活物、 生长因子、 珍稀蛋白等 核酸酶学 属 种 品系 排序 限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下黏性末端） 目的基因克隆的技术路线 获得目的基因 选择合适的可以携带目的基因的载体 把目的基因插入到载体中去，得到重组载体 将重组载体导入宿主细胞进行克隆（通过无性繁殖，随着宿主目的基因也得以扩增） 对重组的克隆进行筛选 使重组的宿主细胞大规模的表达目的基因 黏性末端 （如质粒，噬菌体等） （如细菌） 目的基因克隆的技术路线 利用表型特性，核酸杂交 以及免疫化学等方法对克 隆进行筛选 目的基因的制备 直接从染色体中分离 人工合成 逆转录合成cDNA cDNA文库：用细胞全部mRNA经反转录制备全套cDNA后建库。 构建基因文库 PCR扩增 质粒是可以独立复制 并在细菌之间转移的 遗传单位，质粒还能 赋予宿主菌某种表型 其他的基因载体还有 如：噬菌体，病毒等