上海生科院实验生物学酶工程幻灯片.pptVIP

* * pH曲线的改变 Russell和Fersht提出了改变酶pH曲线的有理设计规则7： 将蛋白质表面变得更带负电荷将提高酸性基团的pKa值，因为它们在离子化时丢失质子。反之，将表面变得更带正电荷则降低所有酸性基团的pKa值。 低离子强度时变化将最大 如果避免多电荷抗衡离子，当离子强度高至0.1 M时会出现明显的变化。 突变设计应避免在活性中心空穴附近聚集抗衡离子。 [7] Russell and Fersht. Rational modification of enzyme catalysis by engineering surface charge. Nature,1987, 328 (6), 496-500 * 还有定向固定化 * * * * 小结与展望 有理设计目前的主要难点看来倒不在于蛋白质序列的惊人多样性使人无从下手，而在于蛋白质结构与功能关系的极度复杂性使我们的理论苍白无力。我们对蛋白质序列如何决定高级结构，高级结构如何影响酶特性所知甚少。具体包括蛋白质序列如何影响蛋白质的异源表达，高级结构的催化活力如何受非天然环境影响等方方面面。许多蛋白质工程实验表明蛋白质性质的改变是许多细微调整的加和。而且，即使某一性状(如稳定性)得以成功改良，其他性状(催化活性和表达水平)却不一定能保持。虽然有理设计不乏成功例子，但也难以改变有理设计“看似有理”，却往往劳而无功的事实和整体成功率低的局面。 以上提到的除了提高催化效率之外，相对都是成功率比较高的有理设计应用。提高蛋白质的热稳定性将变为相对常规的工作。这是由于早先的研究已经确定了影响热稳定性的许多结构特征。成功可能性很高的突变容易被确定。不过，对基本性质和结构之间的关系的理解还非常不充分。提高酶的催化效率相对较难，因为影响活性的结构参数难以清楚地界定。当底物为不溶性大分子时更是这样，而这是大部分重要的工业用酶的实际情况。 其它如底物特异性，对映体选择性也是如此，这些性质的改造看来要结合定向进化的方法比较合适。有理设计将来的进步主要依赖酶结构-功能方面的重大认识突破，其次在于结构生物学方面结构鉴定的进展，和生物信息学方面模建程序的完善。 * 有理设计经常出现的灾难性后果—酶失活使得蛋白质工程策略在上世纪80年代末逐渐转向系统性的单点饱和突变或全序列多重突变，以增加改造成功的机会。并且，这一策略在枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的抗氧化改造等课题上获得了成功。 因此，人们逐渐认识到需要建立产生大量随机突变的方法，辅以高通量的筛选方法可能是蛋白质工程的一条新路(见示意图)。 * 酶的改造可抽象为以亲本序列为出发点在b维蛋白质序列空间中搜索，寻找适合我们需要的蛋白质序列。因此酶改造中的各种序列多样性产生方法实质上都是序列空间中的取样算法，目标是产生覆盖面广，而活性比例又高的序列集合。完全依赖于随机突变技术，以此方法进行“无理”蛋白质设计也取得了成功，特别是在经过多轮突变的例子中。然而，像有理设计一样，由于缺少重组，随机突变本身(例如高突变菌种，易错PCR等)并没有完全体现进化的复杂性。多点突变不易重组导致没法有目的性地勘探功能序列空间。 Error Rates for Thermal Resistant DNA Polymerases This list was originally compiled by Eric First (erfi@eel.sunet.se) and later posted to the bionet.molbio.methds-reagnts newsgroup by Paul Hengen (pnh@). Except where indicated, errors/bp indicates total errors (e.g. base substitutions, frameshifts, etc.). Due to differences in the methods used to determine polymerase fidelity it is best to directly compare values for different enzymes only if they were assayed by the same authors. Vent, Deep Vent, and Pfu all possess 3-5 exonuclease (proofreading) activity. Error Rates 1. Taq (Thermus aquaticus) 1.1 x 10-4 base substitutions/bp (Tindall and Kunkel, 1988) 2.4 x 10-5 frameshift m