光镊技术-北京大学单分子与纳米生物学实验室.ppt

2008-4-2 光镊技术 王也 王学瑛 鲁华菲 郭佳 光镊技术及应用 医学实验05级 王也 王学瑛鲁华菲 郭佳 光镊技术概述和基本原理 光镊系统的组成及操控 光镊在细胞水平的应用 光镊在生物大分子上的应用 光镊系统通常由激光光源、激光扩束滤波光路、光镊移动控制环节、位移检测部分和传统的光学显微镜组成。 光镊的校准对象是光镊技术所探测的位移和力。 先对已知尺度如显微镜标尺进行测量,计算出测量量与标准尺度的转换系数,完成位移标定。使用CCD摄像机做位移测量时,被探测小球成像 半径与CCD像素尺寸之比 与探测精度有关。 对力的标定分为对水平阱力和轴向阱力的标定。 水平阱力的标定通常使用流体力学的方法,认为小球在介质中受到的粘滞力为： F = 6πηrv （Stokes 公式） 此力使小球偏离光阱中心位置,从而产生光阱恢复力。当粘滞力与光阱恢复力相等时小球的位置为平衡位置, 测量此时的位移, 可求出光阱的刚度为： k = 6πηrv/ x 光镊的基本操作功能是对微小粒子的捕获和操控。捕获即夹持物体；所谓操控，就是使目标物体与所在环境实现相对运动，将捕获的目标物体挪动到新的目的地。 被捕获的粒子不动,背景粒子跟随样品台移动。 （箭头表示背景的运动方向） 左侧粒子被光阱捕获，微调物镜，被捕获粒子也随物镜移动；右侧粒子没有受到光阱的控制，不随物镜一起运动，其图像逐渐变得模糊。 阱域R：粒子开始自动滑入至光镊中心的受力范围。 光镊技术的应用 首先，利用光镊技术研究抗原抗体主要是研究二者的结合强度。具体来说：将抗原重建到磷脂脂质体上，形成脂酶体。我们这里就把它看成抗原。然后将抗体与1um聚苯乙烯小球链接。用光镊操控小球与脂酶体接触，使携带抗体的小球与脂酶体上的抗原相互结合。图中发荧光的小球为脂酶体。紧靠它上方的为聚苯乙烯小球。 一脂酶体固定在样品池，另一为抗体小球。图中发荧光的小球为脂酶体。紧靠它上方的为A6D小球 随后用光镊牵拉小球，控制力是有小到大改变，直到刚好可以将小球和脂酶体拉开。具体说这个实验就是当光镊操控力为0.7pN时，仍不能使小球与脂酶体分开。当光镊操控力增大到0.8pN，观察到脂酶体与抗体小球拉开的过程。由这一临界光镊操控力，得出抗原抗体相互间的结合强度 ——3.光镊技术测量生物大分子间的结合强度 说了这么多对细胞应变能力的研究，最后来看看光镊是如何促进细胞融合的。 在研究细胞融合方面，它能把细胞牵引到一起或者用来固定细胞。但是让细胞融合的并不是光镊技术本身。光镊技术只是个辅助技术。 比方说这张图，运用光镊技术可以把左边这个分生孢子固定住，至于它俩怎么融合的，是需要更多的技术。比方说运用化学试剂，像聚乙二醇等。还有人用光镊技术来挑选待融合的特定细胞，并把它们拖到一起相互接触，然后用光刀作用于二者的接触面，诱发细胞融合，这种方法的融合产物具有高的纯度，目的性比较强。 这样做，比方说如果能把波或的精子送到卵周隙协助受精，就很有实用价值了。 2。紫外纳秒激光脉冲与光镊相结合诱导细胞融合为细胞生物学提供了一种单细胞操作,实现细胞融合的手段,但纳秒激光对细胞的热损伤较大。飞秒激光具有单脉冲能量小( nJ ) ,峰值功率密度极高的特点。在生物学应用中,其时空分辨率高等优点被广泛应用于细胞手术、基因转染等研究领域。我们利用飞秒激光为光源实现了集光镊与细胞手术为一体的飞秒激光细胞显微操作系统。利用该系统,实现飞秒激光诱导细胞融合。该成果有望成为单细胞操作实现高效细胞融合的技术手段。——2.3 3.Berns 等首次将光镊同激光微束(光刀) 偶联起来,实现了激光诱导细胞融合。他们用此方法研究了精子的游动并对细胞有丝分裂中后期的染色体进行切割,对染色体的运动、分布进行了深入的研究。Seeger 等利用光镊和光刀偶联实现了染色体的精细切割和高效收集及植物原生质的融合,并研究了细胞内应力的作用及某些微重力效应。Ashkin用三光束法对红血细胞和聚苯乙烯球实现了接触后再分离。Clement 等利用光镊捕获特定精子后通过光穿孔送到卵周隙协助授精,结果证明紫外激光微束和光镊捕获结合可成功地用于显微授精,这为解决医学上的难题带来了曙光。 讲了这么多，都是光镊技术在细胞水平的应用，而随着光镊技术的发展，它能干的事情现已不止于此。我们来看这张图。这里面列了四个我们在讲应用时会用到的大小。我前面提到过红细胞的直径大概是7-8.5um ，而用来研究细胞应变能力的硅球直径一般为1um。它们都在微米水平。但是往上看，细胞骨架里面微管的直径只有25纳米，DNA的直径为2纳米。现在利用光镊技术已经能研究到纳米水平。