细胞生物学方法课稿.ppt

斑马鱼(Danio rerio) 小型脊椎动物。它的许多基因与人类的基因存在对应的关系 3 个月性成熟、产卵多、胚胎体外发育，利于研究胚胎发育过程中细胞行为 小鼠(Mus musculus) 小型哺乳动物，遗传背景清楚，进化方面最接近人类，用于转基因小鼠、基因打靶、条件基因打靶、RNA 干涉以及疾病模型 拟南芥(Arabidopsis thaliana) 十字花科的植物， 广泛用于植物遗传学、发育生物学、细胞生物学和分子生物学的研究 突变体制备技术 在RNA 水平: RNA 干扰的方法 在DNA 水平: 基因敲除(knock out) 基因敲除技术在小鼠中的建立与应用为动物功能基因学和人类疾病小鼠模型作出了重要贡献 蛋白质组学(proteomics)技术 是全面研究细胞、组织乃至整个生命体内蛋白质组成及其活动规律的科学 蛋白质组学技术主要包括蛋白质分离技术(双向凝胶电泳、多维液相色谱、毛细管电色谱等)、蛋白质鉴定技术(如质谱、蛋白质芯片技术等)和生物信息学分析 Thanks for yourattention! 冷冻蚀刻技术 又称冰冻断裂－蚀刻复型技术，观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感，样品不需固定包埋 ? 电镜三维重构与低温电镜技术 电镜三维重构技术是对蛋白质等样品在不同的倾角下进行拍照，再经傅立叶变换等数学处理，展现出生物大分子及其复合物三维结构的电子密度图 低温电镜技术样品不经固定、染色和干燥，直接包被在冰膜中，在电镜内-160 ℃低温下利用相位衬度成像 研究细胞和细胞器三维精细结构的电子扫描断层成像技术 扫描电镜技术 利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌 Figure 9-49 (Molecular Biology of the Cell (? Garland Science 2008) 为了保证样品在扫描观察前不发生表面变形，通常需要利用CO2 临界点干燥法对样品进行干燥处理 样品在观察前还要喷镀一层金膜，以获得二次电子信号 第二节 细胞及其组分的分析方法 超离心技术分离细胞组分 差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开 密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带 细胞成分的细胞化学显示方法 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量 福尔根反应 定性细胞中酶时，样品制备常采用冰冻切片，或以冷丙酮、甲醛进行短时间固定，以尽量保持酶活性 细胞内特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异蛋白的显示可通过抗原－抗体特异结合的方法得以实现 若抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察 为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)，用电镜观察 免疫荧光技术 它包括直接和间接免疫荧光技术两种 免疫电镜技术 在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。免疫胶体金技术受到越来越多的青睐 细胞内特异核酸的定位与定性 原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置 光镜水平的原位杂交技术 (同位素标记或荧光素标记的探针) 电镜水平的原位杂交技术 (生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合) 流式细胞术(flow cytometry) 定量细胞中DNA、RNA 或特异标记蛋白的含量，或细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量 第三节 细胞培养与细胞工程 动物细胞培养 分为原代细胞和传代细胞 细胞系和细胞株 贴壁培养和悬浮培养 植物细胞培养 单倍体细胞培养：用花药或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根，在人工培养基上进行培养最终长成植株 Figure 8-67a Molecular Biology of the Cell (? Garland Science 2008) 原生质体培养: 体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株 细胞工程 细胞融合与单克隆抗体技术 单克隆抗体技术：通过HAT 选择培养获得分泌单抗的杂交瘤细胞株 显微操作技术与动物的克隆 显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等 转基因(GFP)鸡、猪 C. Bruce A. Whitelaw FEBS Letters (2004) 571: 233–236 对照 对照 对照 第四节 细胞及生物大分子 ?的动态变化 荧光漂白恢复技术 高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭。由于生物膜的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复，而定量测定生物膜的流动性 放射自显影技术 利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含