生物化学--核酸化学课件.pptVIP

2.5 核酸的理化性质及其应用 2.5.1 核酸的一般性质 ①RNA为白色粉末，DNA是白色纤维状固体，二者均微溶于水，而不溶于一般有机溶剂中，故常用70%乙醇从水溶液中将核酸沉淀出来。 ②核酸既有碱性基团，又有磷酸基团，故为两性电解质，但酸性强。介质pH大于4时，呈阴离子，电泳时向阳极移动。 ③大多数DNA为线性分子，长度可达数厘米，直径仅为2nm，故DNA溶液粘度很高，分子极易断裂；RNA溶液粘度较小。 2.5.2 核酸的紫外吸收特性（λmax=260nm） 2.5.3 核酸的变性、复性 是双链核酸分子的二个重要物理特性； 双链DNA、RNA双链区、DNA: RNA杂交双链都有此性质。 　 2.5.3.1 核酸的变性（denaturation） (1)变性的概念：双螺旋结构打开，形成无规则线性结构的过程。 (2)结构和性质的变化： 化学键变化：氢键、疏水键断裂，不涉及共价键的断裂。 结构变化：改变核酸空间结构，一级结构不变。 增色效应：DNA变性后，溶液紫外吸收作用增强的效应。 原因：在双螺旋结构中，有序堆积的碱基紫外吸收降低，当DNA变性后，双链解开，碱基外露， 260nm紫外吸收增大，产生增色效应。 (3)变性的因素： 加热 极端的pH 有机试剂（甲醇、乙醇、尿素等）。 DNA的热变性 特点： 狭窄性：变性温度范围小。 爆发式：像晶体的熔点，到达变性温度后，DNA很快变性解链，故名熔解温度。 Tm值的影响因素： ①碱基组成： （G+C）含量越高，双螺旋结构的越稳定，Tm值越大，氢键数G≡C，A=T 。 计算Tm的经验公式(在0.2mol/L NaCl溶液中) : X%（G+C）=2.44（Tm-69.3） 另外，当DNA链碱基数≤20： Tm=4（G+C）+2（A+T） Tm值的影响因素： ②DNA的均一性： DNA分子中碱基组成的均一性：如只含有一种碱基对的多核苷酸片段，Tm值范围很窄，变性时氢链断裂几乎可“齐同”进行 待测DNA样品组成的均一性：如样品中只含有一种病毒DNA，其 Tm 值范围较窄，若混有其它来源的DNA，则 Tm值范围较宽 2.5.3.2　核酸的复性（renaturation) 影响复性的因素 温度和时间 一般认为比 Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，一般为60 ℃左右。 复性时温度下降必须缓慢，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温，复性几乎不可能。核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性（单链）状态。 DNA浓度　　 DNA顺序的复杂性　　 简单顺序的DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）这二种单链序列复性时，互补碱基的配对容易。 顺序复杂的DNA，如小牛DNA的非重复部分（一般以单拷贝存在于基因组中），这种复杂的特定序列要实现互补，显然要比上述简单序列困难得多。 本章重点 五种碱基及相应的核苷酸及脱氧核苷酸的结构式；碱基与戊糖的连接方式；核苷酸残基的连接方式； DNA双螺旋结构的基本要点 tRNA的结构特点 一级结构：由70~90个核苷酸组成单链；含较多的稀有碱基；5ˊ端多为PG 、3ˊ端多为CCAOH 。 二级结构：三叶草形、四臂四环 三级结构：倒“L” mRNA特征 原核生物：多顺反子mRNA 真核生物：单顺反子mRNA， 5′ “帽子” 和3′ “尾巴” 核酸主要的理化性质（相关概念） 变性与复性；增色效应和减色效应 Tm 分子杂交 * * * * 中文名称： DNA印迹法 英文名称： Southern blotting 其他名称： Southern印迹法 将经过凝胶电泳分离的DNA转移到适当的膜(如硝酸纤维素膜、尼龙膜等)上的技术。可以采用毛细管作用或电泳法转移，转移到膜上的DNA再与标记的特异核酸探针杂交等进行分析。 Northern印迹法 　　Northern 印迹法:将RNA固定在硝酸纤维素膜上后,用互补的,具有放射性标记的RNA或DNA探针与其杂交.为了与DNA印迹法(southern印迹法)区别,叫RNA印迹法Northern 印迹法. 中文名称： DNA印迹法 英文名称： Southern blotting 其他名称： Southern印迹法 将经过凝胶电泳分离的DNA转移到适当的膜(如硝酸纤维素膜、尼龙膜等)上的技术。可以采用毛细管作用或电泳法转移，转移到膜上的DNA再与标记的特异核酸探针杂交等进行分析。 Northern印迹法 　　Northern 印迹法:将RNA固定在硝酸纤维素膜上后,用互补的,具有放射性标记的RNA或DNA探针与其杂交.为了与DNA印迹法(southern印迹法)区别,叫RNA印迹法Northern 印迹法. 2.5.1 核酸的一般性质