生物显微技术 第三章 染色和组织化学幻灯片.pptVIP

染色 活体染色：无毒染料注入动物体内，一定时间后取材，固定切片或铺片观察 台盼蓝，台盼红，墨汁。 固定后染色： 媒染剂：组织—媒染剂---染料 复合体。 增强剂：加强染色的选择强度。 加速剂：加强染料的渗透作用。 苏木精(hematoxylin)、伊红（eosin）染色法（ＨＥ染色） 苏木精将细胞核染成紫蓝色，伊红将细胞质（浆）染成红色。 苏木精是具有阳离子的碱性染料，可以与具有阴离子基因的组织成分耦合成盐，凡组织结构对苏木精起紫蓝色反应的称为嗜碱性（basophil）。 伊红是具有阴离子的酸性染料，可以与具有阳离子基因的组织伊红起红色分耦合成盐，凡组织结构对伊红起红色反应的称为嗜酸性（acidophil）。对碱性或酸性染料亲和力均不强者，则称为中性。 Delafield 苏木精液 苏木精 4g 无水乙醇 25ml（溶解） 10%铵矾水 400ml， 甘油 100ml， 甲醇或95%乙醇 100ml。 阳光空气中放3-4个月 石蜡切片苏木精染色步骤 切片脱蜡：二甲苯两次，每次10-20分钟。 梯度酒精下行入水：100%--90%--80%--70%--60%--50%--水 苏木精染色10分钟左右，水洗。 分色：1%盐酸的70%乙醇中。使核着色，核以外的成分无色。水洗。 1%伊红的70%酒精复染1分钟 95%乙醇分色 95%乙醇漂洗，无水乙醇脱水。 无水乙醇：二甲苯=1：1 一次 二甲苯两次 加胶封片 ＨＥ染色结果 细胞核蓝紫色，细胞质、胶原纤维、肌纤维呈不同色调的粉红色。 进行性染色： 退行型染色： 分色 组织化学 定义 组织化学也称细胞化学，是在组织的原位上显示并研究其化学性质和功能关系的一门科学技术。 组织化学是细胞形态学与化学、生物化学之间的边缘科学。根据已知的化学反应，在细胞原位上以化学反应显示出该细胞中的化学成分、性质、及其变化，从而将结构和机能更紧密的联系在一起。 借助这一技术可以： 直接观察到细胞的形态特征； 可以观察到该细胞的化学成分、化学性质； 在不同生理状态下，组织形态、化学性质的变化研究可以阐明细胞的功能。 组织化学的技术要求 保存细胞的生前结构。 保存细胞生前的化学成分和酶活性。 所用的化学方法是已知的化学反应，具有高度的特异性。 反应产物应是一种能形成稳定沉淀的有色物质，供光镜观察；或电子密度高的物质供电镜观察。 组织化学的特点 定性 定位 相对定量 研究细胞或组织中的化学物质。 研究内容 蛋白质：酶类、抗原等具有某种特异功能的蛋白。 核酸：DNA和RNA 糖类 脂类 无机盐和微量元素 糖类显示 核酸显示 分类 一般组织化学 它的基本原理是在组织切片上滴加一定试剂，使它与组织细胞内某种化学物质起反应，并在原位形成有色沉淀产物，通过观察该产物，可对某种化学物质进行定位、定性及定量的研究。 荧光组织化学 它的基本原理是用荧光显微镜以短光波紫外线作光源，紫外线可激发标本内的荧光物质，使其呈现荧光图象，借以了解细胞组织中的不同化学成分的分布。 免疫组织化学 是近年来发展起来的新技术。它的基本原理是利用抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞中某种肽类及蛋白质等大分子物质的分布 酶类的显色方法 酶的分类 水解酶 氧化还原酶 转化酶 连接酶 裂解酶 异构酶 酶的组织化学反应 偶氮染料法 吲哚酚法 金属盐法 氧化-还原反应 碱性磷酸酶钙-钴显示法 原理： RPO3-------ROH+H3PO4 2H3PO4 +3Ca(NO3)2----Ca3(PO4)2 +6HNO3 Ca3(PO4)2 + 3Co(NO3)2 ---- Co(PO4)2 + 3Ca(NO3)2 Co(PO4)2 +3(NH4)2S----3CoS+2 (NH4)3 PO4 碱性磷酸酶作用液(pH9．3) 溶液1：2％甘油磷酸纳 2％巴比妥纳 2％硝酸钙 2％硫酸镁(或氯化镁) 蒸馏水 溶液2： 1％硝酸钙。 溶液3： 1％硝酸钻。 溶液4： 1％硫化铵(临用时现配) 方法 切片脱蜡入水 入碱性磷酸酶作用液作用2h，但在切片入作用液前，应将作用液置37c温箱中30min(注意：对照片在作用液内免去甘油磷酸钠，或进作用液前，放在沸水中煮7—8min)。 过蒸馏水一次，浸入1％的硝酸钙中2-3min。 过蒸馏水一次，浸入1％的硝酸钴中2-3min。 蒸馏水洗1mm，人1％硫化铵1-2min。 自来水冲洗5—6min。 经上行乙醇脱