植物激素的测定方法植物激素测定方法的测定方法.ppt

操 作 步 骤 包被---温育---洗涤---竞争---温育---洗涤---加二抗---温育---洗涤---显色---比色---计算 包 被 每小孔中加入100μl包被缓冲液，然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内。 37 ℃下1.5小时。 洗 板 将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第2次。共洗涤3次。 竞 争 即加标准物、待测样和抗体。 加标样及待测样： 取适量所给标样稀释配成： ABA标准曲线的最大浓度为100ng/ml,然后再依次2倍稀释8个浓度（包括2个0ng/ml，加入前两行的最后两排 ）。将系列标准样加入96孔酶标板的1、2、3行，每个浓度加3孔，每孔50μl,其余孔加待测样，每个样品重复3孔，每孔50μl。 加 抗 体 在微孔中加入一定量的抗体,混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。 竞争条件37℃左右0.5h。 洗 板 将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第2次。共洗涤3次。 加“二抗” 将适当的酶标二抗，加入10ml样品稀释液中（比如稀释倍数1:1000就加10μl），混匀后，在酶标板每孔加100μl，然后将其放入湿盒内，置37℃下，温育0.5h。 洗 板 将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第2次。共洗涤3次。 加底物显色 在每孔中加100μl 邻苯二胺（OPD）溶液（小心勿用手接触OPD），（每10ml溶液中含4μl 30% H202。混匀，然后放入湿盒内，当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加入50μl 2mol/L硫酸终止反应。 比 色 在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。 数 据 分 析 用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，在波长450nm处分别读取各标准孔和样本孔OD值，以OD值为横坐标，“标样激素含量的对数”为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的OD值在标准曲线上查出待测样品的ABA含量的对数。利用反对数求得ABA的绝对含量。 植物激素的测定方法？ 生物活性法 气相色谱（气-质联机） 液相色谱（液-质联机） 酶连免疫法（ ELISA 法） 问题：我们该选择哪种板呢？ ELISA技术的特点与局限性 （1）ELISA特点：在固相表面组装免疫活性物质形成免疫吸附剂；酶标记免疫活性物质，进行信号放大；有二步温育反应二次洗涤过程；灵敏度特异性相对较高。 （2）ELISA局限性：只能检测到ng水平，精密度差（批内CV15-20%）；线性范围窄（一个数量级）。 注意事项 ： 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 抗 原 医学上重要的抗原 抗体（Ab） 抗体（antibody,Ab)是B细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。 免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白 二、免疫球蛋白的分子结构 免疫球蛋白的基本结构 四肽链结构 ，链间二硫键连接 两条重链（H）和两条轻链（L） 氨基端和羧基端。 根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（V）和恒定区（C） 可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较大 恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及 含糖量都比较稳定 单克隆和多克隆抗体的比较和用途 酶：辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶 特异性 敏感性 均一性 McAb PcAb 低 差 无 高 强 有 1、用于免疫学检测，辅助临床诊断 2、McAb用于亲和层析，分离微量可溶性抗原 3、标记的McAb用于基础研究，了解细胞分化等 4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。 多克隆抗体：多个抗原决定基——机体——多种抗体的混合物 单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）：由一个B细胞克隆产生的、针对某一特定抗原决定簇的高度特异性抗体 基因工程抗体 六、人工制备的抗体 * 植物激素的酶连免疫分析法 DNM-9602G酶标分析仪 DNM-9602 标配酶标分析仪 DNM-9602A酶标分析仪 几种酶标分析仪 （1）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分混匀反应。 （2）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤不完全。 （3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。 （4）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴