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1，断头，取脑：断头取脑，生理盐水冲洗 RIPA裂解，冰上操作 2，均浆：匀浆机均浆；冰上放置30min； 样品离心取上清，加loading buffer，煮5min 3，配胶: 分离胶和积层胶 4，上样：微量进样器上样 5，电泳：80V，40min；然后120V，约2-3h 6，转膜：配转移缓冲液，滤纸，NC膜； 110V，90min 7，封闭：脱脂奶粉，室温2h 8，加一抗：4°过夜 9，洗膜 10，加二抗：室温1h， 11，洗膜 12，显色 Western blot实验具体操作步骤 ① ② ③ ④ ⑤ 蛋白酶在细胞破碎时可能会释放出来，其会导致某些蛋白的降解。因此裂解细胞制备蛋白样品时，需要加入蛋白酶抑制剂。蛋白酶在低温下无活性 * 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶胀而释放出细胞内容物 细菌细胞或组织培养细胞可采用冻融裂解 超声仪可产生超声波，通过切应力来裂解细胞。在剧烈搅拌的状态下产生剪切效果。 应用对象：悬浮细胞 步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，样品处理应在冰浴中进行。 机械匀浆法：先尽量将组织剪成块，然后加蛋白酶抑制剂的冷匀浆液进行匀浆，过滤或离心收集 玻璃珠均浆：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置于结实的管子中，每克细胞加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min，冰浴1min。重复上述步骤 * * Western blot 实验技术 定义： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，利用相应的探测反应 来检测样品的一种方法 其中，Western blot是分子生物、生物化学和免疫遗传等研究常用的实验方法 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC）上，并利用 DNA-RNA杂交检测特定DNA片段的方法，称为Southern印迹法 之后，人们用类似的方法对RNA和蛋白质进行印迹分析, 对RNA的印迹分析 称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分析的印迹分析称为Eastern印迹法。 Western blot基本原理 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。 基本过程： ☆经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如NC膜或 PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质 ☆以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免 疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应 ☆经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因 表达的蛋白成分。 Western blot的一般流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 转膜 封闭 洗涤 二抗杂交 洗涤 一抗杂交 底物显色 蛋白样品制备原则 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解， 低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解 样品裂解液应该分装冻存-80°，勿反复冻融已 制备好的样品 蛋白样品的制备 蛋白样品的制备方法 水溶液提取法 该法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和 缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提 取蛋白质最常用的溶剂，如RIPA细胞裂解液 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取， 如采用乙醇，丙酮和丁醇等。 细胞裂解方法 ※ 含去污剂的裂解液裂解 溶解细胞膜，裂解细胞，释放内容物 冻融裂解 液氮迅速冷冻细胞，随后在37°融化，快速反复冻融几次 超声裂解法 通过切应力裂解细胞，如用于含坚硬细胞壁的酵母细胞 研磨法 冻存于液氮中，随后研磨成粉末 ※ 机械匀浆法 将组织切成小片，加入预冷的均浆缓冲液，简单匀浆， 通过过滤或离心获得裂解液 玻璃珠匀浆法 剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁 蛋白酶抑制剂防止蛋白降解 苯甲基磺酰氟（Pheylmethylsulfornyl fluoride，PMSF）: 不可逆的抑制剂