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细胞侵袭试验 5．下室加入600 μl的有血清的培液，并加入相应浓度的药物和DMSO。 6．37度孵育16小时。 7．90%乙醇固定30分钟。 8．PBS洗两次，0.2%结晶紫染色30分钟，PBS洗两次，用酒精棉球擦去上表面的细胞，显微镜下拍照。 9．10%乙酸抽提20分钟，酶标仪600 nm测OD值。 10.抑制率（%）=(OD对照孔-OD给药孔)/ OD对照孔×100%。 Transwell Transwell：trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well 有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。 杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1--12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 （1）共培养体系：? 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 1．Transwell肿瘤细胞迁移实验 ??????? 过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。 2．Transwell上皮细胞培养步骤 (1) 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca2＋、Mg2＋，无血清的MEM。 (2) 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。 (3) 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10%胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5%胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。 (4) 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90%，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5%CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6-10天。 (5) 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000-2000Ω之间，即可用于电生理试验。 显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片 3. Transwell B16细胞的体外迁移实验 ??????首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一层fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。 4．内皮细胞HMEC-1迁移实验 ??????? 1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100μl用serum-free MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并