2-基因组DNA鉴定与PCR.ppt

1. 基因组DNA鉴定2. 聚合酶链式反应 基因组DNA鉴定 准备材料： ddH2O——仪器初始化、清洁样品平台 Buffer——空白对照 10uL以下加样枪及配套枪头 擦镜纸 记录用纸笔 待测量样品 Nanodrop分光光度计操作说明 1. 双击电脑屏幕上的Nanodrop图标，启动软件。 2. 选择所需的测量模式（Nucleic Acid Measurement)，屏幕上会弹出初始化仪器的提示，往仪器的加样孔中加入2微升的蒸馏水，合上上盖使形成液柱,然后点击确定以开始初始化，可以听见电磁阀开合的声音。 3. 五六秒后屏幕上的提示信息消失，表示初始化完成。用擦镜纸将蒸馏水擦干净，加入2微升的Buffer，合上上盖并点击Blank(在Sample Type的下拉列表中选择样品类型DNA-50)。 4. Blank完成后，用擦镜纸将Buffer擦干净即可以开始上样，加入2微升的样品，点击Measure开始测量。 双击启动Nanodrop软件，进入以下界面 点击Nuceic Acid Measurement（核酸测量），会跳出以下对话框，往加样孔里加入2ul蒸馏水，合上上盖使形成液柱，然后点击OK确定，仪器开始初始化并发出哒哒声。 结果： 读取样品的浓度与A260/A280，A260/A230 (思考： A260/A280和A260/A230对核酸鉴定的意义？） 建议: 在每次测量完毕后，用蒸馏水清洁样品平台，这样可以保证下一次测量的准确性； 每次测量的样品量建议不少于2微升。 A260nm：是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内； A280nm：是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50％蛋白质/DNA溶液 A230nm：是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。 PCR 实验原理 PCR技术是利用DNA的变性、复性原理在体外进行特定的DNA序列高效扩增的技术，在试管中，在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶进行的酶促合成反应，由变性-退火-延伸反复循环完成扩增。 操作步骤 1. 反应体系的配置 2. 反应条件的设置 3.产物的鉴定和分析 PCR反应体系配置 1. ddH2O 14uL 2. 10×buffer 2uL 3. dNTP 2uL 4. 引物P1 0.4uL 做好记号 5. 引物P2 0.4uL 6. Taq DNA-pol 0.2uL 7. 模板: 对照组 ddH2O 1uL（四组做一管对照） 实验组 基因组DNA 1uL（每组一管） 反应条件设置 94℃ 5min ×1 第一步—预变性 94℃ 20s 55℃ 20s ×30 第二步—循环 72℃ 20s 72℃ 5min ×1 第三步—再延伸 反应产物检测 琼脂糖凝胶电泳 实验结果 DNA Marker(DL2000) * * 图1 图2 图3 图4 Blank完成后，在Sample Type的下拉列表中选择DNA－50，单位为ng/ul)，用擦镜纸将加样孔和上盖的液体擦干净，然后向加样孔中加入2ul样品，点击Measure，可以看到如下结果 *