第三章蛋白质的通性、纯化与表征.ppt.ppt

* 第三章 蛋白质的通性、纯化与表征 1、蛋白质的理化性质： 酸碱性质、胶体性质与沉淀、变性、颜色反应 2、分离纯化的方法： 盐析、电泳、等电聚焦、层析等 3、表征： 活力、比活力 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳 1、酸碱性质 阳离子 PHPI 阴离子 PHPI 兼性离子 PH=PI 可解离基团有末端和侧链 故pI与酸性、碱性氨基酸的数目有关 如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性 有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定 没有盐类干扰时的等电点叫等离子点 蛋白质分子的颗粒直径已达1-100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 2、蛋白质的胶体性质： 蛋白质的胶体性质 布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力 蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）； 2）带相同电荷。 3)大小为1-100nm的胶体颗粒 + + + + + + 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。 蛋白质的沉淀作用 加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。 分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。 2. 加有机溶剂 加重金属盐 加生物碱试剂 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和条件有机溶剂沉淀法等。 可逆沉淀 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、常温有机溶剂、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 不可逆沉淀 一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性。 二、变性的实质是破坏了蛋白质的空间结构，并不引起一级结构的改变。 蛋白质的变性 三、蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都变性后的蛋白质。 四、加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。 反应名称 试 剂 颜色 反应有关基团 有此反应的蛋白质或氨基酸 双缩脲反应 NaOH、CuSO2 紫色或粉红色 二个以上肽键 所有蛋白质 米伦反应 HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物 红色 ? Tyr 黄色反应 浓HNO3及NH3 黄色、橘色 ? Tyr、Phe 乙醛酸反应 (Hopking-Cole反应) 乙醛酸试剂及浓H2SO4 紫色 ? Trp 坂口反应 (Sakaguchi反应) α-萘酚、NaClO 红色 胍基 Arg 酚试剂反应 (Folin-Cioculteu反应) 碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸 蓝色 酚基、吲哚基 Tyr 茚三酮反应 茚三酮 蓝色 自由氨基及羧基 α-氨基酸 ? 4、蛋白质的颜色反应：鉴定蛋白质的量 —OH N 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染色 5、蛋白质的紫外吸收 分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度 依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性 若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整 难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶的天然结构都没有发生变化） 蛋白质的分离与纯化方法 （一）盐析与有机溶剂沉淀： 盐溶 盐析： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的