绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达【胡美娟-四川大学.ppt

Part01 Part02 Part03 具体实验步骤 P01 质粒DNA的提取 质粒DNA的提取 P02 质粒DNA的提取 P03 感受态细胞经转化培养后，平皿内有但菌落长出。 用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37 ℃, 180 r/min振荡培养过夜。 取1.5 ml 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 ℃、11000 r/min 离心1分钟，吸弃上清。 Part01 Part02 Part03 具体实验步骤 P04 质粒DNA的提取 质粒DNA的提取 P05 质粒DNA的提取 P06 向离心管中加入150 ?l用冰预冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重悬沉淀。 加入200 ?l新配制的溶液 Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟 加入150 ?l用冰预冷的溶液 Ⅲ，轻轻混匀，冰上放置3~5分钟。 Part01 Part02 Part03 具体实验步骤 P07 质粒DNA的提取 质粒DNA的提取 P08 质粒DNA的提取 P09 用微量离心机于4 ℃、11000 r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。 加等体积氯仿400 ?l抽提，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。 用70%乙醇洗涤2次，再次4 ℃、11000 rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。向已干燥的离心管内加20 ?l超纯水溶解质粒DNA，加入TE缓冲液（其中含2 ?l 10 mg/ml RNA酶），37 ℃处理1小时后于-20 ℃贮存。 吸取上清液300 ?l，向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心5分钟，弃上清。 质粒DNA的检测 1.琼脂糖凝胶板的制备 质粒DNA的检测 2.加样 质粒DNA的检测 3.电泳 质粒DNA的检测 4.观察和拍照 具体实验步骤 称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。待胶液冷却到650C（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，（如右图）缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子 ）内 。静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。 胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL Loading Buffer（ 6× ）混匀，加入胶板的样品小槽内。 将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。 将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。 具体实验步骤 酶切及连接 分别取两支0.2mlEP管做上记号：如①② 两个EP管中分别配置下列的30 μL体系： 具体实验步骤 5. 3. 酶切及连接 4. 将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱370C酶切1h。 取5μL ① ② EP管的酶切反应液，同时取5μL原质粒溶液作对照，进行电泳检 测酶切结果。 按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段 模板来自于 / * 模板来自于 / * 模板来自于 / * 模板来自 / * 模板来自 / * 模板来自于 * 模板来自 / * 模板来自于 * 模板来自 / * 绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达 胡美娟 2013141241164 陈彦立 2013141241169 四川大学生命科学学院 生物科学基地班 目 录 1 2 3 4 5 6 实验背景 实验用品及方法介绍 实验流程 实验原理 具体实验步骤 实验结果预测 7 参考文献 200810月8日，瑞典皇家科学院宣布，2008年诺贝尔化学奖由日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健获得，他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方面取得了突出成就。 实验背景 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962 年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。 它是由238 个氨基酸构成的“β-桶” 型三维立体结构, 其中第 65 ~ 67 位氨基酸( 丝氨酸 -酪氨酸 -甘氨酸) 形成发光团, 为主要发光的位置。 GFP的演化 通过生物化学的方法将基因做小小的改变, 就可以改变GFP中的氨基酸, 得到变异GFP。 目前应用较多的是GFP的突变体—增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）。EGFP将GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光强度比GFP大6倍以上。 所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、