质谱的蛋白质组相对定量新方法和新技术-生物分子高效分离与表征.doc

国家重点基础研究发展计划（重大科学研究计划）课题年度报告 项目编号：2012CB910600 项目名称：蛋白质定量新方法及相关技术研究 2012CB910602 课题名称：基于色谱-质谱的蛋白质组相对定量新方法和新技术 2012年12月1日 一、年度计划执行情况 1．年度计划完成情况 按照项目年度计划要求，本年度重点开展了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量的新方法；开展了iTRAQ 结合 18O标记相对定量技术；发展了针对非标记定量技术的归一化新算法；和编写了定量软件pQuant。按项目任务书的规定，完成了研究内容和预期目标。 在二级质谱定量方面：发展了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量新方法该方法针对目前所发展的基于二级质谱by离子定量方法的局限性，开发一种适用于所有蛋白样品分析、基于常规的酶解、价格低廉的等重标记的b, y离子对二级质谱定量方法，对定量蛋白质组学研究具有重要的现实意义。 在目标糖蛋白质定量方面发展了iTRAQ 结合 18O标记相对定量技术该方法用18O酶促标记，在糖基化位点处引入质量标签，可实现糖肽的定量；在肽段层面上引入iTRAQ质量标签，可实现多组样品的同时定量；并且由于在糖肽、非糖肽中均引入了质量标签，可以实现糖基化程度和蛋白水平的同时定量。 在二级质谱定量的算法方面发展了通过提取串级质谱中 b，y 碎片离子对的峰强度信息来得到肽段和蛋白的定量信息的ITMSQ算法为了避免串级质谱图中b， y碎片离子对共碎裂谱图对肽段正确定性的影响，在ITMSQ定量软件中加入了一个“谱图拆分”优化模块后，显著减少了b，y 碎片离子对共碎裂谱图对正确定性和定量的影响。 在非标记定量的算法方面发展了一种归一化新算法：以两种二级谱碎片离子强度SI (Spectral Index) 和SMT (Summed MS/MS TIC) 作为蛋白质丰度表征值，以蛋白长度作为校正因子的归一化算法NSI (Normalized SI/L) 和NSMT (Normalized SMT/L)，显著降低了定量的RSD值。 在定量软件开发方面编写了pQuant软件设计了可以识别干扰色谱峰的打分算法Interference Score，将该算法整合入定量软件pQuant后，使得pQuant的定量准确性较常见定量软件Census有很大提高。发表SCI 论文 21 篇； 申请国家发明专利 1个，授权发明专利1个。 2.1 建立了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量的新方法 为解决之前所发展的二级质谱定量IVATAL方法只适合于细胞培养样品的问题，使之可以适用于更广泛的样品来源，包括组织等，以及不能使用常用的胰蛋白酶、定量率低的问题，发展了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量的新方法。将两组对照样品的胰蛋白酶酶解肽段分别在H216O或H218O水中进行胰蛋白酶催化的标记反应，所有以赖氨酸（Lys，K）和精氨酸（Arg，R）结尾的酶解肽段的C-末端会被标记上两个16O或18O原子，产生4 Da的差异。标记肽段经胍基化修饰后，分别进行二甲基化标记，其中16O标记的样品与氘代甲醛（CD2O）反应，18O标记的样品与甲醛（CH2O）反应。这样两组样品中的相同肽段实现了等重标记，在一级质谱（MS1）中重叠成单峰，但是在二级质谱（MS2）中产生成对的b, y离子对。用标准蛋白对该方法的考察结果显示：该方法有很好的准确性和重现性，在10倍以内有很好的线性关系（R2＞0.99）。对肝癌患者癌症组织样品和癌旁正常组织样品的蛋白质组进行相对定量分析，总共定量到124个显著变化的蛋白质，其中上调45个，下调79个。很多蛋白质的变化与之前文献报道的变化一致，说明此方法可以应用于大规模实际样品的分析，得到的结果准确、可靠。 2.2 发展了“iTRAQ plus 18O标记相对定量技术旨在建立适用于多样本，稳定快速的高通量糖基化位点占有率分析的方法，为目标糖蛋白宏观不均一性的研究提供技术手段。采用iTRAQ和18O两种标记方法，即采用iTRAQ标记非糖肽和糖肽，18O标记糖基化位点，放大串联四极杆飞行时间质谱仪的母离子检测窗口。将此项技术运用于正常人(N)及肝病(肝癌 HCC、肝硬化 LC，肝炎 HBV)患者血清中结合珠蛋白血清β亚基四个糖基化位点占有率的研究，发现结其Asn241糖基化位点占有率在肝癌血清中显著升高，有着重要的潜在诊断价值。该技术一方面实现了目标糖蛋白质在糖基化修饰水平和蛋白水平的同时定量，另一方由于18O在糖基化位点处引入标记，提高了糖基化位点鉴定的准确性。 2.3 发展了二级质谱定量的算法为了使Isobaric MS2定量方法得到广泛应用，基于IVTAL方法和SEQUEST 搜索引擎